腫瘤免疫微環境中免疫細胞間通訊景觀探究

任麗萍，寧 琳，謝 雷，張 楊

(1. 成都東軟學院健康醫療科技學院 成都 611844；2. 電子科技大學醫學院 成都 611731；3. 成都中醫藥大學中醫藥創新研究院 成都 611137)

腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)是指腫瘤所生存的細胞環境，主要包括腫瘤細胞、成纖維細胞、間充質細胞、血液和淋巴管，以及各種腫瘤浸潤免疫細胞與相關趨化因子和細胞因子等[1]。如此數量眾多且各不相同的細胞以及細胞外基質在各種層面和尺度上相互調控和交流，共同塑造TME[2]。TME 是腫瘤生長發育的溫床，探究TME中發生的各種生物學過程和相互作用對于腫瘤的發展機制以及臨床診療研究至關重要[3]。

TME 中存在各種先天免疫細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞、先天淋巴細胞和NK 細胞等) 以及適應性免疫細胞(T 細胞和B 細胞等)[4]。當腫瘤微環境與這些免疫細胞的功能及信號交流有關時，又可被稱為腫瘤免疫微環境(tumor immune microenvironment, TIME)[5]。癌癥的發展和演進受TIME 中免疫細胞組分的影響并受宿主免疫系統的控制。文獻[6-7] 研究表明，TIME 中不同免疫細胞的比例及某些免疫系統相關生物標志物可用于癌癥檢測、預后及治療反應的評估。此外，TIME 中還包含多種潛在的癌癥治療靶點[8-10]，如CTLA-4 和PD-1/PD-L1 等免疫檢查點阻斷相關的靶點是目前腫瘤靶向治療的熱點[11-12]。同時，癌細胞與TIME 中免疫細胞之間的串擾會產生促進腫瘤生長和轉移的環境，對于腫瘤的發生和演進非常重要。如在TIME 中，腫瘤細胞表面的配體PD-L1 與T細胞表面受體的PD-1 之間的互作，使得腫瘤細胞免疫抑制信號傳遞到T 細胞內部，抑制T 細胞免疫功能，從而阻止免疫系統攻擊腫瘤細胞，產生免疫逃逸[13]。而針對PD1/PD-L1 的免疫抑制劑已是目前腫瘤免疫治療最熱的靶點[14]。但在TIME 中，除了腫瘤與免疫細胞之間的通訊交流，不同的免疫細胞間的交流同樣對腫瘤的發展起重要作用。文獻[15] 研究表明，細胞外空間中免疫細胞和基質細胞的募集、成功激活和重編程是TIME 中免疫細胞相互調控和交流的結果。如M2 巨噬細胞可通過分泌TGF-β 以及IL10 抑制CD8+ T 細胞功能，促進腫瘤細胞的免疫逃逸[16]。嗜酸性粒細胞可通過分泌CXCL9、CXCL10 及CCL5 募集和激活T 細胞，通過分泌IL-6、IL-12 和CXCL10 募集NK 細胞，并誘導M1 極化[17]。NK 細胞可通過自分泌和旁分泌PGE 和TGF-β 等細胞因子的方式調節自身的腫瘤免疫殺傷功能[18]。因此，進一步探究TIME 中免疫細胞間的信號通訊網絡對于腫瘤演進機制以及開發新的腫瘤免疫治療手段具有重要價值。

最近，快速發展的單細胞RNA 測序(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)技術可在單細胞水平上精確表征腫瘤組成，提供對腫瘤的異質性和基因表達的高分辨率景觀，是剖析TIME 的有力工具[19]。目前已有大量研究利用scRNA-seq 技術探究各種癌癥的TIME 中的細胞景觀，為解析TIME 與腫瘤發生發展機制提供了重要線索[20-24]。但此類研究主要關注腫瘤細胞與免疫細胞間的信號通訊，而TIME 中不同免疫細胞間的信號通訊網絡探討較少。因此，為深入挖掘TIME 中免疫細胞間的通訊網絡，本文收集多套TIME 的單細胞測序數據，并結合最新的細胞間通訊預測算法和工具[25-26]，嘗試解析TIME 中不同免疫細胞間的信號通訊網絡，以揭示腫瘤在免疫微環境中的協調和發展機制，并進一步為腫瘤的臨床診斷和治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 單細胞數據集收集

本文共收集8 套腫瘤樣本及3 套正常樣本的CD45+細胞的測序數據，數據集相關信息如表1 所示。腫瘤數據包括兩套肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、 兩套頭頸癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)、一套黑色素瘤(melanoma)、一套乳腺癌 (breast carcinoma, BRCA)、一套透明細胞腎癌(clear cell renal carcinoma,ccRCC)以及一套透明細胞腎癌類器官(clear cell renal carcinoma organoid, ccRCCO)的數據。正常樣本數據包括兩套肝臟組織以及一套乳腺組織數據。以上數據涵蓋了10X 以及smart-seq2 兩種測序技術平臺。

表1 CD45+細胞scRNA-seq 數據集

1.2 單細胞數據處理

首先從Gene Expression Omnibus (GEO)數據庫下載11 套數據集的count 數據及meta 數據，使用Seurat3.0 默認參數對所有數據初步過濾，要求每個細胞內檢測到的線粒體基因比例小于10%，利用log2[TPM/10+1]對基因表達值進行標準化。

1.3 細胞身份識別

使用Garnett (Version: 0.1.20)算法對細胞的身份進行識別[27]。研究7 種免疫細胞，包括樹突狀細胞(dendritic cell, DC)、自然殺傷細胞(natural killer cells, NK)、單核/巨噬細胞(monocytes/macrophages，mono/macro)、B 細胞(B cells)、T 細胞 (T cells)及其兩個亞型：CD4 T 細胞(CD4 T cells)與CD8 T 細胞(CD8 T cells)。不同免疫細胞的細胞標志物(marker)信息如表2 所示。部分Garnett 算法未成功注釋的unkown 細胞在后續的分析中被過濾掉。

表2 7 種免疫細胞的標志物

1.4 使用CellCall 推測細胞間通訊

使用CellCall 算法推測TIME 中不同免疫細胞間通訊關系[25]。CellCall 算法通過整合配體-受體(ligand-receptor, L-R)互作的表達和L-R 互作下游轉錄因子(transcription factor, TF)的激活程度來推斷細胞間通訊關系。同時，CellCall 還嵌入了一個通路激活分析算法來識別不同細胞間通訊所涉及的關鍵信號轉導通路。在使用CellCall 算法推測細胞間通訊之前，本文排除了在特定細胞類型的少于10%的細胞中表達的基因。

1.5 高變異細胞間通訊關系篩選

為了篩選在腫瘤與正常樣本中高變異的差異通訊關系，本文首先計算每條通訊關系在腫瘤與正常樣本間的差異倍數(fold change, FC)；然后使用R 包“statmod”擬合不同通訊關系的FC 值方差的廣義線性模型。廣義線性模型是線性模型在研究響應值的非正態分布以及非線性模型的線性轉化時的一種發展，用以篩選在不同細胞間高變異的信號通訊關系。其原理為利用廣義的線性模型擬合所有通訊關系在不同的FC 均值情況下的期望方差，若某細胞間通訊關系的實際方差值顯著高于期望方差，即高于期望方差的1.5 倍，則該通訊關系為高變異的信號通訊關系。

1.6 統計分析

泛癌表達譜數據來自于TCGA 數據庫，包括33 種癌癥的表達譜數據以及臨床資料信息。使用R 包“survival”中的Kaplan-Meier、log-rank 檢驗和單變量Cox 回歸評估TF 表達與生存時間之間的關系。使用Metascape 對差異基因進行功能富集分析[28]。使用Wilcoxon 秩和檢驗評估正常與腫瘤樣本中細胞間通訊強度的差異(P＜0.05)。

2 結果與討論

2.1 腫瘤與正常樣本中免疫細胞間通訊比較

為探究腫瘤與正常樣本TIME 中免疫細胞間的整體景觀以及差異，本文使用CellCall 算法分別對11 套TIME 樣本進行細胞間通訊預測。結果如圖1a 和1b 所示，7 種免疫細胞在正常樣本和腫瘤樣本中均存在大量的細胞間通訊關系。正常樣本與腫瘤樣本的整體細胞間通訊強度的比較分析如圖1c 所示，發現腫瘤樣本中不同免疫細胞間存在更強的細胞間通訊(P=2.6×10-5)。可見，在免疫微環境中不同免疫細胞之間存在大量高度復雜的交流和通訊網絡，但相對來說，在腫瘤樣本中免疫細胞間的交流更加頻繁與密切。因此，進一步探究腫瘤中特異以及缺失的細胞間通訊關系，對于理解腫瘤在機體內的發生發展過程及臨床診斷治療研究具有重要價值。

圖1 腫瘤與正常樣本中免疫細胞間通訊分析

2.2 腫瘤與正常樣本間差異的細胞間通訊關系

為進一步篩選腫瘤與正常樣本間不同免疫細胞之間顯著差異的細胞間通訊關系，本文通過對每條細胞間通訊關系在腫瘤與正常樣本中的FC 值去擬合廣義線性模型曲線，篩選高變異的細胞間通訊關系，如圖2a 所示。得到了12 條在腫瘤和正常樣本間顯著存在差異的細胞間通訊關系，其結果如圖2b 所示，主要包括各種趨化因子-趨化因子受體信號(CCL3/CCL3L3-CCR5、CXCL12-CXCR4)、白介素-白介素受體信號(IL15-IL2RG、IL1B-IL1RAP、IL10-IL10RA、IL10RB) 以及Notch 通路信號(LFNGNOTCH1/NOTCH2)。已有大量文獻證明這些細胞間通訊信號關系與腫瘤免疫顯著相關[29]。如CXCL12-CXCR4 可介導漿DC 細胞的腫瘤浸潤和TREG細胞歸巢至骨髓微環境，并參與腫瘤細胞的增殖、轉移及腫瘤血管生成[30-33]。LFNG- NOTCH 信號可介導T 細胞發育失調，導致腫瘤微環境中T/B 細胞比例改變，影響腫瘤免疫過程[34-35]。

進一步探究部分差異通訊關系下游存在的轉錄因子，如圖2c 所示，發現這些通訊關系下游的轉錄因子主要包括NFKB 家族(NFKB1、NFKBIA 與NFKBIB) 以及STAT 家族(STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B 與STAT6) 及其他腫瘤相關轉錄因子。這些轉錄因子在免疫細胞的分化與腫瘤發展密切相關[36-37]。

圖2 腫瘤與正常樣本間高變異的差異細胞間通訊關系

2.3 細胞間通訊下游轉錄因子與腫瘤預后

為進一步明確相關細胞間通訊信號關系與腫瘤預后的關系，本文分析了這些差異細胞間通訊下游的10 個關鍵轉錄因子與不同腫瘤的預后相關性。通過對TCGA 數據庫中33 種腫瘤進行預后分析發現，這些轉錄因子在部分腫瘤中呈現顯著的預后相關性，如圖3 所示。一些轉錄因子在不同的腫瘤中存在相反的預后情況，如IKBKB 的表達在HNSC、BLCA 及ACC 等腫瘤中是顯著的風險因素，在LGG 中卻是顯著的保護因素。但是，一些轉錄因子在大多數腫瘤中的預后卻趨向于一致，如STAT5B在ACC、KIRC、LAML 及PAAD 等腫瘤中均是顯著的風險因素，如圖4 所示。以上結果提示，這些差異的細胞間通訊關系以及下游轉錄因子與TIME 的發展相關，值得深入研究以揭示腫瘤在免疫微環境中的協調和發展機制，并進一步為腫瘤的臨床診斷和治療提供線索。

圖3 轉錄因子泛癌預后分析的氣泡圖

圖4 STAT5B 與6 種癌癥的預后生存曲線

3 結 束 語

在TIME 中，除了腫瘤細胞與免疫細胞之間的交流之外，不同免疫細胞間的信息交流對與腫瘤的發生發展也具有重要作用[16]。本文通過收集多種腫瘤組織CD45+細胞的單細胞測序數據，推測不同免疫細胞間存在的細胞間通訊關系，并與正常樣本進行比較。結果發現，免疫細胞間通訊在腫瘤樣本中更加頻繁，且該通訊關系多涉及各種趨化因子-趨化因子受體信號、白介素-白介素受體信號以及Notch 信號通路。此外，轉錄因子與腫瘤生存期的生存分析發現部分轉錄因子與多種腫瘤的預后顯著相關。因此，本文構建的腫瘤免疫微環境中不同免疫細胞間的全局通訊景觀，有助于理解各免疫細胞在腫瘤發生發展中的通訊關系及表明相關轉錄因子在腫瘤預后的輔助提示作用。

本文仍然存在不足之處。首先，腫瘤與正常樣本來源于多種不同組織，為非配對樣本。同時，由于細胞數量的限制，本文只注釋了7 種重要的免疫細胞，還有更多的免疫細胞及亞型未得到有效識別。此外，篩選出的差異通訊信號關系，未進行進一步的實驗驗證。在后續研究中，將收集更全面和豐富的TIME 及配對樣本的單細胞測序數據，嘗試識別更多種免疫細胞及亞型，探究其相互間通訊景觀，深入研究其機制機理。