不同性質的肺部磨玻璃結節(jié)患者炎癥和免疫因子水平的比較研究

李 杰，王 蘭

(江蘇省江陰市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 江陰 214400)

肺癌已經成為全球及我國發(fā)病率和致死率最高的腫瘤，發(fā)病率逐年增加[1]。肺部磨玻璃結節(jié)指的是在高分辨率CT圖像上表現為肺內密度輕度增加，呈局灶性云霧狀密度的結節(jié)，其內的支氣管及血管束可顯示。隨著影像學技術的不斷完善和廣大居民體檢意識的日益提高，肺部磨玻璃結節(jié)的發(fā)病率在日益增加。很多醫(yī)院還專門設立了肺部磨結節(jié)的多學科門診。在CT掃描中發(fā)現的肺部磨玻璃樣變性當中最終有一部分確診為惡性腫瘤。對于肺部磨玻璃結節(jié)的性質鑒別是當前臨床工作的一個難點，尋找一種簡便、無創(chuàng)的方法聯(lián)合CT檢查發(fā)現結節(jié)的不同影像學特征來鑒別肺部磨玻璃結節(jié)的性質是研究的方向。已有研究顯示肺癌患者的肺組織當中存在有慢性炎癥[2-3]，各種炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)參與了肺損傷和疾病進展。本研究通過比較不同性質的肺部磨玻璃結節(jié)患者血清當中的炎性及免疫因子的水平，為肺部磨玻璃結節(jié)性質的鑒別診斷探索一種新的方法。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2018年2月—2019年1月我院收治的肺部磨玻璃結節(jié)患者108例，所有患者之前均未接受過放化療及手術治療，均排除存在各種感染和自身免疫系統(tǒng)疾病，近期曾使用激素及免疫抑制劑以及存在其他部位腫瘤的患者。由2名長期從事CT診斷的影像科主任醫(yī)師對所有入選患者的影像進行判讀，通過胸外科手術明確肺部結節(jié)性質，根據病理結果和CT表現分為肺癌組(A組)、良性多發(fā)磨玻璃結節(jié)組(B組)、良性孤立性肺部磨玻璃樣結節(jié)組(C組)。3組性別、年齡、平均動脈壓、體重指數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information of three groups

1.2研究方法

1.2.1實驗室設備和試劑 主要實驗室設備：酶標儀、流式細胞儀、特定蛋白質儀器。相關試劑盒：TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒，Multiset三色試劑，λ型輕鏈測定試劑盒和κ型輕鏈測定試劑盒。

1.2.2炎癥因子檢測 收集清晨空腹靜脈血3～5 mL，將血清提取并儲存在-80 ℃的冰箱中。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。①樣品稀釋：在ELISA板上設置10個標準孔，并將100 μL樣品分別加入第1和第2孔中，分別加入50 μL稀釋溶液。從第1孔及第2孔中取100 μL樣品，并分別加入到第3孔和第4孔中，分別加入50 μL稀釋溶液。接下來，從第3個和4個孔取50 μL樣品并加入到5和6個孔中，分別加入50 μL稀釋溶液。將樣品稀釋5倍，最后得到稀釋樣品。②加樣和孵育：將稀釋的樣品加入樣品孔中，膜封閉后在37 ℃孵育30 min; 然后將板洗滌5次(20 s/次)；③酶促溫育：加入50 μL酶標記的試劑在37 ℃孵育30 min，然后洗滌板5次(20 s/次)；④顯色和終止：將彩色顯影劑A和B(每個50 μL)加入到標準孔中以在20 ℃溫育15 min，然后加入50 μL終止緩沖液。使用酶標儀(波長450 nm)在15 min內讀取光密度(optical density，OD)值，并計算TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平。

1.2.3T淋巴細胞亞群水平檢測 收集清晨空腹靜脈血3～5 mL，樣品中白細胞(white blood cell,WBC)數量控制在(4～10)×109/L。當WBC<4×109/L時，加入4 mL淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心20 min分離單個核細胞；當WBC>10×109/L時，使用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)溶液進行稀釋。根據多重三色試劑盒的說明，將5 μL CD3-PC5/CD4-RD1/CD45-PITC和CD3-PC5/CD8-ECD/CD45-PITC分別加入2個TruCount管中，將40 μL樣品加入到2個TruCount管中并充分混合，然后在20 ℃溫育15 min；然后加入500 μL FACS溶血素并充分混合，然后在20 ℃在黑暗處溫育15 min；在2 500 r/min離心3 min后取上清液，然后加入300 μL 9%氯化鈉溶液。使用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+水平，并計算CD4+/CD8+比率。

1.2.4免疫球蛋白檢測 收集清晨空腹靜脈血2～3 mL，完全凝集并以2 000 r/min離心10 min。 取上清液，加入9%氯化鈉，加入稀釋溶液。 根據特定蛋白質儀器的說明進行免疫比濁法測定，自動檢測免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)水平。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.13組患者炎癥因子指標比較 A組、B組患者TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組與B組患者TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.23組患者T淋巴細胞亞群水平比較 A組、B組患者CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組和B組CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.33組患者免疫指標比較 A組、B組患者IgG、IgA、IgM水平顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組與B組患者IgG、IgA、IgM水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表2 3組患者炎癥因子指標比較Table 2 Comparison of inflammatory factors in three groups

表3 3組患者T淋巴細胞亞群水平比較Table 3 Comparison of the levels of T lymphocyte subsets in three groups

表4 3組患者免疫指標比較Table 4 Comparison of immune indexes of three groups

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率逐年增加，已成為許多國家危及人類健康的主要惡性腫瘤。2015年我國新發(fā)肺癌病例約為78.7萬例，發(fā)病率為57.26/10萬，是男性發(fā)病首位，女性發(fā)病第2位的惡性腫瘤。因肺癌死亡的例數居我國惡性腫瘤死亡首位，2015年我國因肺癌死亡例數約為63.1萬例，病死率為45.87/10萬。17個癌癥注冊中心的數據分析顯示，我國肺癌患者的年齡標化5年相對生存率由2003—2005年的16.1%僅增加至2012—2015年的19.7%。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)在肺癌中的比例高，約占85%，手術治療的Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者術后1年生存率可達70%，5年生存率可達30%。然而，其中超過70%的NSCLC患者就診時已有局部或遠處轉移(Ⅲb～Ⅳ期)，失去手術切除的機會，說明早期診治尤為重要[4-5]。近年來肺部磨玻璃結節(jié)的研究越來越受到關注，但其病理診斷常遇到困難，有學者認為肺部磨玻璃的變化應該列入肺癌前病變研究。影像學檢查是發(fā)現早期肺磨玻璃結節(jié)的主要方法之一。肺磨玻璃結節(jié)的病因很多，包括吸煙、空氣污染和遺傳因素等[6-7]。TNF-α是由單核/巨噬細胞分泌的一種可溶性多肽細胞因子。當機體受損、感染或患有某些腫瘤時，機體會產生大量TNF-α，血清濃度也會增加，從而引發(fā)炎癥反應[8]。IL-1是白細胞介素家族的成員，包括IL-1α和IL-1β，可刺激T細胞產生各種炎癥因子[9]。IL-6是白細胞介素家族的重要成員，其釋放對肺部疾病是一個危險信號[10]。IL-10水平升高可導致機體處于體液免疫的高反應狀態(tài)，在多種腫瘤中均高表達[11]。本研究顯示，肺癌與良性的彌漫性磨玻璃結節(jié)患者中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義，且均明顯高于良性孤立性磨玻璃結節(jié)患者。原因可能是腫瘤細胞激活單核細胞的浸潤和轉移，促進TNF-α的分泌。TNF-α與IL-1β、IL-6和IL-10等炎癥介質發(fā)生作用，增強炎癥反應。彌漫性肺部磨玻璃結節(jié)也會出現肺組織損傷，故TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平、也較高，接近肺癌。孤立性肺部結節(jié)無纖維化改變和間質炎癥反應，所以炎癥因子水平較低，但仍然不容忽視。IgG是一種在抗感染中起主要作用的抗菌和抗病毒抗體；IgA可以形成局部免疫；IgM是一種能溶解致病菌，凝集和吞噬作用的高效抗體，在早期防御中發(fā)揮重要作用[12-13]。肺癌患者與良性彌漫性肺部磨玻璃結節(jié)患者的IgG、IgA和IgM水平差異無統(tǒng)計學意義，且均顯著低于孤立性磨玻璃樣結節(jié)患者。原因可能是因為免疫球蛋白直接中和TNF-α，阻斷抗原抗體反應,減少炎癥因子釋放。肺癌與良性肺部彌漫性磨玻璃結節(jié)患者中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達水平高，導致IgG、IgA和IgM水平降低。T淋巴細胞亞群中的CD3+是成熟T細胞表面上的抗原呈遞，可以輔助鑒定T細胞抗原受體。CD4+是具有免疫調節(jié)功能的輔助T細胞，CD8+T細胞可導致免疫功能障礙的細胞毒性T細胞[14-15]。肺癌患者和良性彌漫性磨玻璃樣結節(jié)患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平差異無統(tǒng)計學意義，明顯低于良性孤立性磨玻璃樣結節(jié)患者。原因可能是T淋巴細胞亞群的水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移密切相關，患者常常患免疫失衡和免疫功能低下。CD3+、CD4+和CD8+在肺微環(huán)境中處于平衡狀態(tài)，它能正常調節(jié)機體的細胞免疫應答，受多種炎癥細胞因子影響，其表達水平會發(fā)生改變; 炎癥越嚴重，平衡越受到損害，并且會產生顯著的免疫抑制，從而減少其數量。 隨著肺部疾病的不斷進展，CD4+/CD8+比率明顯下降，誘導失衡，引起肺組織病理生理改變[16]。對于肺部磨玻璃結節(jié)的患者，檢測血清中的炎癥及免疫指標可能可以成為預測結節(jié)良惡性的一個輔助參考因素，但是需要擴大樣本數量開展進一步研究，及同無結節(jié)的健康人作比較進行分析。

綜上所述，肺癌和良性肺部彌漫性磨玻璃結節(jié)患者的炎癥因子水平顯著高于良性單發(fā)磨玻璃結節(jié)患者，免疫因子的水平顯著低于良性單發(fā)磨玻璃結節(jié)患者。檢測肺部磨玻璃結節(jié)患者血清中炎癥因子和免疫因子水平可考慮作為鑒別肺部磨玻璃結節(jié)良惡性的一種輔助手段。影像學結合血清學檢查可為肺癌的鑒別診斷提供較好的依據，實現對肺癌病變的早期干預，具有重要的臨床意義。