基于RANKL/RANK/OPG通路研究絕經后老年骨質疏松患者骨代謝與腸道菌群失調的關系

宋 昕，孫 瑩，張 琦，耿 濤

(應急總醫院干部療養科，北京100020)

骨質疏松癥是一種全身性骨代謝疾病，主要表現為骨密度降低、骨微結構破壞，增加骨折發生的風險，是世界公共衛生的重大問題之一[1]。患者以女性居多，絕經后骨質疏松癥的發生率超過35%，嚴重影響老年女性生活質量和生命安全[2]。腸道菌群是人體內最大的生態系統，近年來隨著研究的深入發現腸道菌群失調與腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病的發生具有密切聯系[3]，而腸道菌群失調能夠通過調節機體免疫、激素水平以及骨代謝等方式促進骨質疏松癥的發生和進展，是導致老年女性骨質疏松癥的重要因素[4]。研究表明，核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)-核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)-骨保護素(osteoprotegerin，OPG)通路在維持骨吸收與骨形成的平衡中發揮重要作用，外源性OPG具有延緩骨質流失的作用[5]。但目前腸道菌群失調通過RANKL/RANK/OPG信號通路調節骨代謝影響骨質疏松癥發生發展的研究尚不完全明確，本研究通過對絕經后老年骨質疏松患者骨代謝與腸道菌群失調的關系進行研究，旨在為老年女性骨質疏松癥的預防和治療提供相關依據。報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2019年1月—2021年1月于我院就診的老年骨質疏松老年女性患者177例為研究對象，骨質疏松診斷依據《絕經后骨質疏松的影像學表現及診斷標準》[6]，所有患者行腸道細菌涂片培養后計算雙歧桿菌/腸桿菌值，根據《腸道菌群失調診斷治療建議》[7]將患者分為研究組(腸道菌清失調，雙歧桿菌/腸桿菌<1，78例)和對照組(腸道菌群未失調，雙歧桿菌/腸桿菌>1，99例)。2組患者均為絕經后女性，研究組年齡53～75歲，平均(62.15±8.21)歲、對照組年齡52～75歲，平均(62.21±7.13)歲；認知功能正常、生活能力正常、臨床資料完整，無合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、重要臟器功能障礙及精神神經疾病。

本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過,所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2腸道菌群的分離及鑒定 所有患者入組后收集1 g左右新鮮糞便于潔凈容器中，采用10倍稀釋法進行稀釋后進行培養，使用法國梅里埃公司VITEK2 Compact全自行微生物鑒定系統檢測微生物分布情況，主要檢測糞便中雙歧桿菌和腸桿菌，結果采用(lg菌落數/g)表示。見表1。

表1 2組腸道菌群比較Table 1 Comparison of intestinal flora between two groups 菌落數/g)

1.3炎癥因子及骨代謝指標水平檢測 患者入組后次日清晨空腹抽取靜脈血5 mL于無菌管中，3 000 r/min離心10 min收集上層血清，采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測血清中白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BALP)、25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]、抗酒石酸鹽酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b)等骨代謝指標水平，嚴格按照試劑盒說明書所述步驟進行，血清ELISA試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。

1.4RANKL/RANK/OPG通路蛋白水平檢測 無菌抽取患者膝關節囊內關節液于無菌管中，加入RIPA蛋白裂解液于冰上裂解40 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒進行校準，加入4×Loading Buffer煮樣后進行聚丙烯酰胺-凝膠電泳，電泳結束將蛋白轉入PVDF膜中，封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的一抗于4 ℃條件下孵育過夜，次日再加入二抗室溫孵育1 h，檢測RANKL、RANK、OPG蛋白表達水平，以GAPDH最為內參，以目標蛋白灰度值/內參灰度值為蛋白相對表達量，RANKL、RANK、OPG兔抗人一抗均購自美國CST公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗及Western-blot試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司，Simon 全自動Western-blot監測分析儀購自美國ProteinSimple公司。

1.5統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗，相關性采用Spearman相關性分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組患者血清炎癥因子水平比較 研究組患者血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.22組患者血清骨代謝指標比較 研究組患者血清OC、BALP、TRACP-5b水高于對照組，血清25(OH)D水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.32組關節液RANKL/RANK/OPG通路相關蛋白表達情況比較 研究組患者關節液中RANKL、RANK蛋白相對表達量高于對照組，OPG蛋白相對表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表2 2組IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較Table 2 Comparison of IL-6，TNF-α，and TGF-β1 levels between two groups

表3 2組血清OC、BALP、TRACP-5b、 25(OH)D水平比較Table 3 Comparison of serum OC,BALP, TRACP-5b and 25(OH)D levels between two groups

表4 2組關節液RANKL、RANK、OPG蛋白 相對表達量比較Table 4 Comparison of the relative expression of RANKL, RANK and OPG protein in synovial fluid between two groups

2.4研究組腸道菌群和骨代謝指標的相關性 研究組雙歧桿菌與血清25(OH)D水平呈正相關(r=0.332，P<0.05)，與血清OC、BALP和TRACP-5b水平呈負相關(r=-0.318、-0.408、-0.371，P<0.05)；腸桿菌與血清25(OH)D水平呈負相關(r=-0.378，P<0.05)，與血清OC、BALP和TRACP-5b水平呈正相關(r=0.356、0.343、0.364，P<0.05)。

3 討 論

骨質疏松癥是常見的骨質退化性疾病，隨著我國人口老齡化的加重骨質疏松癥患者也日益增多，骨密度降低導致的骨量水平降低是其主要臨床表現，增加患者骨折風險[8]。骨代謝過程包括舊骨吸收和新骨形成2個過程，兒童以及青少年使其骨形成過程大于骨吸收，使骨骼增長迅速，骨容量在30歲左右達到峰值。而在女性絕經以及男性50歲之后，骨吸收過程大于骨形成，使得骨量減少，骨質脆性增加，導致骨質疏松的發生和發展。老年女性絕經后骨質疏松癥又稱Ⅰ型原發性骨質疏松癥，雌激素水平大量下降是導致其發生的重要原因[9]。雌激素能夠與破骨細胞內雌激素受體結合促進降鈣素分泌，同時減少骨吸收水平，促進骨質重建和生成，而雌激素減少后不僅上述過程減弱，還促進RANKL水平升高，促進破骨細胞生長分化，導致骨吸收增強，使骨強度下降，骨量降低[10]。近年來研究表明，腸道菌群失調能夠導致骨代謝異常，骨質疏松癥患者糞便標本中放線菌屬、蛋雞菌屬和梭狀芽孢桿菌屬豐度增加，不僅通過調控骨代謝和維生素D的吸收調控骨質生長，還能夠通過分泌瘦素、OPG等激素參與骨的代謝，是導致骨密度降低、骨脆性增加的重要因素[11-12]。

本研究結果顯示，研究組血清OC、BALP、TRACP-5b水平明顯升高，25(OH)D水平明顯降低，且腸道雙歧桿菌與25(OH)D水平呈正相關，與OC、BALP和TRACP-5b水平呈負相關，而腸桿菌則與25(OH)D水平呈負相關，與OC、BALP和TRACP-5b水平呈正相關，提示腸道菌群失調能夠引起骨代謝異常，可能是導致骨質疏松的重要因素之一。

研究表明，RANKL/RANK/OPG通路與骨代謝密切相關，RANKL與RANK相結合后促進c-Fos蛋白表達增多，與活化T淋巴細胞結合后促進破骨細胞生成相關特異性基因表達增強，促進破骨細胞的生長和分化并抑制其凋亡，增強骨破壞進程，使得骨吸收活性增強[13]。而OPG能夠競爭性與RANK相結合，且結合能力較RANKL更強，從而有效阻止破骨細胞反應的傳導，在破骨細胞形成和分化過程中發揮負性調節作用[14-16]。本研究結果顯示，研究組關節液中RANKL、RANK水平明顯升高，OPG水平明顯降低，提示腸道菌群可能通過調控RANKL/RANK/OPG通路減少OPG表達，促進破骨細胞生長分化，有利于骨吸收和骨破壞的發展，可能是導致老年女性骨質疏松的原因之一。

炎癥反應也是導致骨質疏松癥的重要原因，如通過增強免疫反應、促進氧化應激、加劇炎癥反應程度等途徑影響骨代謝微環境，促進破骨細胞的增殖和分化促進骨質代謝，促進骨質疏松癥的發生和進展[17-18]。炎癥因子還能夠作用于成骨細胞，通過激活核因子κB等信號通路負性調節成骨細胞分化、抑制Wnt/β-catenin通路抑制Sema3B蛋白表達等途徑抑制成骨細胞的分化和生長，導致骨質疏松癥的發生[19-21]。本研究結果顯示,研究組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平明顯高于對照組，提示腸道菌群失調可能通過調節機體炎癥因子水平促進骨質疏松癥的發生。

綜上所述,腸道菌群失調的老年女性血清OC、BALP、TRACP-5b升高,25(OH)D水平降低，關節液內RANKL、RANK蛋白表達增多，OPG蛋白表達減少，血清炎癥因子水平升高，促進了骨質疏松癥的發生和進展。本研究的不足之處在于樣本量較少，且納入研究的患者時間跨度較小，可能導致研究結果存在一定程度的偏倚，需要在后續的研究中進一步擴大樣本量以及研究時間跨度，以減少研究誤差，使研究結果更具有科學依據。