回旋狀脈絡膜視網膜萎縮一家系的新型突變與臨床觀察

張文華，但漢東，李曉麗，黃子旭，宋宗明

0引言

回旋狀脈絡膜視網膜萎縮(gyrate atrophy of choroid and retina，GA)是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，是由于編碼線粒體酶鳥氨酸轉氨酶(ornithine aminotransferase，OAT)的OAT基因(OMIM 258870)突變引起的，該酶是精氨酸和鳥氨酸轉化為主要的興奮性和抑制性神經遞質谷氨酸和γ-氨基丁酸的關鍵酶。流行病學研究顯示，GA的全球發病率約為1/1500000[1]，其主要的眼部癥狀和體征包括夜盲、高度近視、早期白內障形成以及脈絡膜視網膜環形萎縮、黃斑病變等，萎縮性病變具有扇形或花環狀邊界，因此稱為“回旋狀”[2]。

OAT基因定位在常染色體10q26.13，全長22kb[3-4]。30多年前，第一次在GA患者中發現了OAT突變[5]，OAT基因在脈絡膜視網膜中高度表達，尤其在視網膜色素上皮層活性最高[6-7]。HGMD(Human Gene Mutation Database)數據庫顯示該基因存在68種不同的致病性突變，突變基因位點分布在整個基因序列中，沒有明顯的突變熱點，大部分突變類型為錯義突變，其次是無義突變和移碼變異，還有剪接變體和一種影響ATG起始密碼子的突變[1]。雖然目前已明確多種變異類型，但仍有很多致病性突變尚未發現。本研究采用全外顯子組測序檢測一個中國GA家系兩代人(共6名家庭成員)的致病突變，通過對每名家庭成員進行常規眼科檢查及全外顯子組測序分析來探究與該家系GA相關的致病性變異及分子學病因。

1對象和方法

1.1對象回顧性分析2019-06/2021-08于我院治療的GA患者的臨床資料。納入標準：(1)明確診斷為GA，全外顯子組測序分析顯示存在OAT基因新型致病性變異；(2)參與本研究的親屬與確診患者存在血緣關系、能夠配合所有檢查。排除標準：(1)合并其他眼部疾病的患者；(2)接受過內眼手術、受過眼部外傷的患者。所有患者均就診于河南省立眼科醫院，本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，研究內容符合《赫爾辛基宣言》的宗旨，所有參與者或其監護人均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床檢查對先證者及其相關的家庭成員采集詳盡的家族史及臨床數據，進行最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡、彩色眼底照相以及頻域光學相干層析成像(SD-OCT)等眼科檢查，并通過氣相色譜質譜聯用儀測定外周血液中鳥氨酸的濃度。

1.2.2全外顯子組測序和生物信息學分析抽取該家系中6名家庭成員的外周血樣本，每個血液樣本約5mL，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(51106)從全血中提取DNA，通過Qubit及瓊脂糖凝膠電泳測定提取的DNA樣本含量及質量。應用Roche SeqCap EZ MedExome Kit進行目標區域捕獲，使用Illumina Hiseq X-ten二代測序儀對富集的文庫進行PE150測序，平均測序深度為100X，測序后得到FASTQ格式的原始數據，再進行生物信息學分析，在二代測序檢測出的突變位點中進行Sanger驗證排除假陽性。

1.2.3Sanger驗證和共分離分析根據變異位點信息在UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在線工具上查找對應的基因組序列，利用Prime Primer 5軟件設計引物。引物在PCR過程中用于擴增樣本中包含變異位點的基因片段。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶并判斷產物的大小與擴增情況。利用Axygen的AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)對PCR產物進行純化，通過Qubit對回收的PCR產物進行定量后再進行第二輪PCR，即Sanger PCR。然后利用BigDye XTerminatorTMPurification Kit(4376486)對產物進行純化，利用ABI的Applied Biosystems?3730xl DNA Analyzer進行測序，最后在Sanger測序峰圖上找出需要測序的位點，并判斷是否有變異。

2結果

2.1臨床表現該家系中共6名家庭成員參與研究。先證者(Ⅲ:3)為6歲女童，因自幼視力差，近1a來視力明顯下降伴夜盲就診。既往無特殊病史。否認父母近親結婚史及家族性遺傳學疾病史。患者發育正常，神經系統未見異常。最佳矯正視力：右眼-5.75DS/-2.75DC*180=0.4；左眼-5.50DS/-3.25DC*5=0.25。眼壓：右眼14.7mmHg；左眼16.2mmHg。裂隙燈顯微鏡檢查雙眼前節未見異常，玻璃體輕度混濁；眼底檢查可見周邊部視網膜色素上皮細胞和脈絡膜毛細血管萎縮，視網膜脈絡膜萎縮呈鋪路石樣改變，病灶邊界清楚，形態不規則，萎縮病灶之間的視網膜正常(圖1)。SD-OCT檢查雙眼可見視網膜神經上皮囊樣改變，視網膜劈裂且劈裂累及黃斑，右眼和左眼中心凹厚度分別為439、483μm(圖2)。外周血鳥氨酸濃度為360.57μmol/L(參考范圍41～290μmol/L[8])。先證者的叔叔(Ⅱ:1)、父親(Ⅱ:2)、母親(Ⅱ:3)、哥哥(Ⅲ:1)、姐姐(Ⅲ:2)均無任何異常癥狀或體征。先證者因其臨床表現與體征被診斷為GA。

圖1 先證者眼底照相結果 可見雙眼周邊部視網膜呈鋪路石樣改變，視網膜、脈絡膜萎縮，部分萎縮病灶相互融合成片，邊緣呈花瓣狀，黃斑區可見劈裂。A：右眼；B：左眼。

圖2 先證者SD-OCT檢查結果 雙眼可見神經上皮囊樣改變，視網膜劈裂且劈裂累及黃斑，右眼和左眼中心凹厚度分別為439、483μm。A：右眼；B：左眼。

2.2全外顯子組測序結果全外顯子組測序結果顯示，先證者的OAT基因存在復合雜合型突變，在第6外顯子和第10外顯子上分別發現錯義突變c.722C>T(p.P241L)和無義突變c.1186C>T(p.R396X)。該錯義突變導致所編碼的氨基酸由脯氨酸變為亮氨酸。該無義突變使1個編碼氨基酸的密碼子變為終止密碼子，提前終止多肽鏈的合成，導致截短蛋白的產生，從而引起OAT基因表達異常。患者的父親(Ⅱ:2)和哥哥(Ⅲ:1)均檢出雜合型p.R396X致病變異，患者的母親(Ⅱ:3)檢出雜合型p.P241L致病變異，其他樣本未檢出。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)變異分類標準，p.R396X為致病變異，p.P241L為可能致病變異(表1)。

表1 高度影響患者表型的變異

2.3Sanger驗證與共分離分析Sanger驗證結果顯示，先證者在變異位點OATc.1186C>T出現的變異類型與其父親及哥哥一致，在變異位點OATc.722C>T出現的變異類型與其母親一致。該家系的Sanger驗證結果見圖3，遺傳圖譜見圖4。通過多種算法預測，在變異位點OATc.722C>T出現的p.P241L錯義變異類型是有害的。這兩種變異在多人口種族數據庫中的可匹配人群不多見，除上述變異類型外，不存在可能對患者表型有影響的變異，以及與患者部分臨床表型相關的其它變異。

圖3 Sanger驗證基因測序圖譜 A：Sanger驗證對6名家庭成員在突變位點OAT c.1186C>T的基因測序圖譜顯示先證者(Ⅲ:3)與其父親(Ⅱ:2)、哥哥(Ⅲ:1)均檢出雜合型p.R396X致病變異，這種突變類型因堿基G突變為堿基A引起。紅色：先證者的突變堿基；黃色：先證者父親和哥哥的突變堿基。B：Sanger驗證對6名家庭成員在突變位點OAT c.722C>T的基因測序圖譜顯示先證者(Ⅲ:3)和其母親(Ⅱ:3)檢出雜合型p.P241L致病變異，這種突變類型因堿基G突變為堿基A引起。紅色：先證者的突變堿基；黃色：先證者母親的突變堿基。

圖4 OAT基因突變家系的遺傳圖譜 先證者為復合雜合性突變，該突變類型在家系中呈完全共分離狀態。圓圈：未受影響的女性；方框：未受影響的男性；單斜線符號：未納入本研究的家庭成員；多斜線符號：檢出雜合型的參與者；黑色實心圓圈：先證者。

3討論

本研究納入的家系成員中，先證者OAT基因的第6外顯子和第10外顯子上分別發現錯義突變c.722C>T(p.P241L)和無義突變c.1186C>T(p.R396X)，這是一種復合雜合型變異，前者為首次報道的變異類型，來源于其母親，后者來源于其父親，除先證者以外，其余家庭成員均無異常表現。先證者存在接近-6.00D的近視和2.00D以上的散光，以視力下降和夜盲為主要癥狀，晶狀體目前未見異常，眼底表現出典型的回旋狀視網膜脈絡膜萎縮灶，暫無其他系統的特殊表現。但因先證者年齡小，暫時無法有效配合視野檢查，我們會在隨訪過程中補充。本研究通過全外顯子組測序技術、生物信息學分析、Sanger驗證及共分離分析，明確了導致GA的基因突變位點及家系遺傳方式。

典型的GA本質上是一種眼科疾病，首先會累及周邊部視網膜色素上皮，隨后由周邊部向后極部進行性發展同時伴發漸進性視野縮小，最終導致全脈絡膜視網膜病變[9]。早期表現為夜盲，青少年時期出現后囊下白內障，最遲在60歲時導致失明[10]。眼底照相能夠直觀反映病灶形態。結合眼底熒光素血管造影(FFA)有助于GA的早期診斷，FFA所顯示的病變范圍可以超出眼底檢查所見的范圍，有利于發現位于赤道部小范圍的早期淡黃色病灶[11]。此外，視野檢查也有助于判斷疾病進展的情況，早期視野可無明顯改變，后期逐漸出現進行性向心性視野縮小，形成管狀視野[12]。也有研究報道了發生于骨骼肌、中樞及周圍神經系統的眼外表現，然而，在多數情況下，這些系統的表現是亞臨床的[13]。無脈絡膜癥(choroideremia，CHM)與GA有類似的臨床表現，CHM是由于X染色體長臂上的CHM基因缺失或突變導致的，其男性患者發病較早，通常癥狀從早期的夜盲癥逐漸發展為周邊視野缺失，到晚年僅存中心管狀視野，最終失明；而女性患者一般為攜帶者，無臨床癥狀[14]。眼底典型表現為早期視網膜色素上皮細胞變性，眼底呈椒鹽狀，中期病變逐漸從周邊視網膜向后極部發展，晚期眼底色素上皮幾乎完全被破壞，脈絡膜血管消失并萎縮，鞏膜外露，僅殘留黃斑區一小塊邊界清楚的脈絡膜[15]。

OAT能將精氨酸和鳥氨酸轉化為主要的興奮性和抑制性神經遞質谷氨酸和γ-氨基丁酸，是該途徑中的關鍵酶。缺乏這種酶會導致血漿和組織中的鳥氨酸水平升高，進而對視網膜產生毒性作用[8]。有研究者認為二氫吡咯羧化物(P5C)缺乏或肌酸缺乏對視網膜功能的拮抗作用是重要的致病因素[16]。P5C是鳥氨酸與脯氨酸之間的中間產物，由OAT和P5C合酶合成。生理濃度鳥氨酸對P5C合酶有抑制作用，OAT缺乏會導致鳥氨酸堆積及P5C生成減少。因此，在GA患者中，形成P5C的兩條通路均出現障礙，從而導致脯氨酸合成減少或P5C調節作用受損，視網膜細胞內因脯氨酸缺乏而引起眼病[17-18]。此外，精氨酸在甘氨酸轉氨酶作用下合成肌酸，但鳥氨酸是甘氨酸轉氨酶的強競爭性抑制劑，所以GA患者也會出現肌酸代謝異常進而出現相應的肌肉病變，如Ⅱ型肌纖維萎縮和肌無力[19]。GA患者血清、尿液、腦脊液、房水中的鳥氨酸濃度可以為正常人的10～20倍[20]，通過限制精氨酸的攝入可以限制鳥氨酸的來源，補充維生素B6也是可選擇的治療方法，部分患者經過治療可將血清鳥氨酸濃度降低到正常水平，從而減緩病情惡化及視力喪失的進度[21]。也有部分患者僅存在GA眼底表現，但沒有血液鳥氨酸濃度的升高[22]。本研究中先證者外周血鳥氨酸濃度為360.57μmol/L，高于正常值范圍，目前正通過飲食控制精氨酸的攝入，需定期隨訪。

遺傳性眼病不同變異類型的臨床表現不盡相同，明確基因型和臨床表型之間的關系有利于輔助基因治療的研究[23]。王曉光等[4]在OAT基因第4外顯子和第10外顯子上發現雙等位基因突變c.461G>A(p.R154H)和c.1186C>T(p.R396X)，該患者除GA眼底表現外，存在綠色和藍色色盲，雙眼視野向心性縮小，視網膜電圖示視桿細胞和視錐細胞的a和b波呈熄滅型，同時合并血鳥氨酸濃度的嚴重升高。Jalali等[16]在OAT基因第5外顯子發現純合型突變c.425-1G>A，該患者除GA眼底表現外合并有高鳥氨酸血癥和中度肌無力。本研究中的先證者年齡尚小，目前處于疾病早期階段，隨著疾病的進展視力是否會進一步下降，是否會出現白內障、色盲或其他癥狀仍需隨訪觀察。