大豆蛋白肽聚集體與EGCG復合納米顆粒及其乳液特性

董亞博，蘭 天，付元濤，孫書境，李 萌，江連洲，隋曉楠，張 妍,2,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

酶水解大豆蛋白不僅具備豐富的營養價值還具備多種生物活性[1]。Zhang Lei等[2]研究表明大豆蛋白的特異性水解產物具有清除自由基和過渡金屬螯合活性。同時García-Nebot等[3]還發現大豆蛋白的一種水解肽對亞油酸的過氧化進程有抑制作用。此外，從大豆蛋白中提取的多肽還具有降低膽固醇和體脂、預防骨質疏松、抑制血管緊張素I轉換酶和抗高血壓等多種對健康有益的特性[4]。然而，在大豆蛋白水解過程中，由于疏水性氨基酸或疏水性蛋白的暴露，會不可避免地發生肽-肽聚集或蛋白-肽的相互作用，從而形成不溶性肽聚集體[5]。這些不理想的聚集體質量可達總質量的40%，顯著降低肽的可提取性和提取率。此外，這些聚集體通常被丟棄或用作動物飼料的原料，從而大大降低大豆蛋白的利用率，也增加對環境的不利影響。

(－)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）作為一種只存在于茶中的天然兒茶素（其他兒茶素也存在于水果和蔬菜中），通常被作為綠茶產品的質量指標[6]。EGCG是一種強大的抗氧化劑，可以保護食物和生物體免受自由基介導的氧化損傷。此外，蛋白質與多酚之間的相互作用也會通過修飾蛋白質分子影響其生理活性。已有研究[7]證明兒茶素與大豆蛋白的結合會引起蛋白結構和功能的變化。研究[8]表明EGCG與β-乳球蛋白通過疏水相互作用和氫鍵改變蛋白質二級結構，形成更加穩固的結構。在堿性條件下（pH 9.0），茶多酚與大豆蛋白的共價相互作用使蛋白質粒徑變大，疏水性降低，顯著提高蛋白質的乳化能力和乳液穩定性[9]。Kerckhoffs等[1]研究發現，經EGCG修飾后，大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）結構變得松散，暴露出更多的活性基團，從而使其發泡、乳化和抗氧化性能得到改善。

盡管已有研究表明大豆蛋白肽聚集體（soybean peptide aggregates，SPA）具有作為一種優良的乳液穩定劑的潛力[10]，但目前獲得的信息仍然非常有限。因此，本研究試圖通過與EGCG復合進一步改善SPA的理化特性，提高大豆蛋白的水解利用率，達到大豆蛋白的高值化利用，以期減少酶解廢棄物對環境的影響，并為SPA在食品工業中的進一步應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI由實驗室自制；葵花籽油 市購；EGCG（純度98%） 西安通澤生物技術公司；堿性蛋白酶2.4 L（2.4 AU/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；Microfuge 20R冷凍離心機 美國貝克曼公司；數顯恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；X’pert PRO衍射儀 荷蘭PANalytical公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Zhang Qiaozhi等[11]的方法稍加修改。大豆磨粉過篩，與正己烷混合3 次脫脂得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉溶于去離子水中，并用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0，45 ℃連續攪拌2 h后，6 000×g離心30 min后收集上清液，用2 mol/L HCl溶液調節上清液pH值至4.5以沉淀蛋白質，6 500×g離心20 min收集沉淀。將得到的沉淀用去離子水洗3 次，并用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至中性，冷凍干燥，得到SPI粉末。

1.3.2 SPA的制備

以SPI為原料，采用酶解法制備SPA。將凍干SPI與去離子水混合使其質量濃度為4 g/100 mL。然后加入1 g/100 mL堿性蛋白酶，并用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.5，溫度保持50 ℃，反應3 h。反應結束后，將溶液加熱到85 ℃并保持10 min，然后置于冰水中冷卻降至室溫，使堿性蛋白酶滅活終止反應。隨后，用2 mol/L HCl溶液中和，調節pH值至7.0，并于8 000×g離心20 min，分離不溶性蛋白聚集物即為SPA。

1.3.3 納米顆粒的制備

參照Liu Fu等[12]的方法稍作修改進行納米顆粒的制備。將凍干SPA粉末分散于去離子水中，連續攪拌2 h，配制質量濃度為10 mg/mL的SPA分散液，4 ℃過夜，以確保完全水化。將EGCG粉末按凍干SPA粉末質量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%加入SPA分散液中，室溫下避光攪拌2 h得到SPA-EGCG復合物溶液。取不同添加比例的SPA-EGCG復合物溶液各30 mL進行超聲（900 W、25 kHz）處理10 min，得到SPA-EGCG納米顆粒（SPA-EGCG nanoparticles，ESNPs）。以未加入EGCG的納米顆粒（SNPs）為對照。ESNPs和SNPs以液體形式或凍干保存在4 ℃冰箱中，用于特性分析。

1.3.4 納米顆粒粒徑的測定

參考鞠夢楠等[13]的方法，測定前用pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將質量濃度10 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液稀釋100 倍，以避免聚集。

1.3.5 納米顆粒Zeta電位的測定

參考Tao Fei等[14]的方法，為避免顆粒聚集影響測定結果，用pH 7.0、0.01 mol/L PBS將10 mg/mL 的SPA、SNPs和ESNPs分散液稀釋1 000 倍，過0.45 μm水系膜后進行Zeta電位測定。

1.3.6 納米顆粒熒光光譜測定

根據Zhang Nanhai等[15]的方法，將10 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液用10 mol/L PBS在室溫下稀釋100 倍。用熒光分光光度計測定熒光光譜。發射光譜范圍300～500 nm，激發波長280 nm。

1.3.7 納米顆粒X射線衍射的測定

利用X’pert PRO衍射儀，設置參數為電流40 A，電壓40 kV。Cu Kα X射線波長為0.1541 8 nm。在2θ4～75°、掃描速率0.056 °/s條件下捕獲X射線衍射圖。

1.3.8 乳液制備

參照Yang Han等[16]的方法加以修改。將40 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液與葵花籽油混合，油相體積分數（φ）40%～60%，總體積20 mL。使用均質機于12 000 r/min均質2 min，制得乳液。

1.3.9 乳化性及乳化穩定性測定

根據You Yaohui等[17]的方法，將新制乳液用0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液稀釋100 倍。使用紫外分光光度計測定，并以相同濃度SDS溶液調零。混勻后立即讀取樣品在500 nm波長處吸光度（A0）。放置10 min后，記錄相同波長下吸光度（A10）。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）分別按式（1）、（2）計算：

式中：n為樣品稀釋倍數100；ρ為納米顆粒質量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數/%。

1.3.10 乳液粒徑測定

參照1.3.3節方法進行。

1.3.11 乳液初級氧化產物測定

按照Shantha等[18]所述方法測定初級氧化產物脂質過氧化值（peroxide values，POV）。將乳液倒入玻璃小瓶在60 ℃條件下加速氧化7 d，每天取樣評估乳液的氧化穩定性。將15 mL醋酸-氯仿（3∶1，V/V）與0.3 mL乳液充分混合，渦旋振蕩10 s后，2 000×g離心10 min，取上清液0.2 mL與2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）、15 μL 3.9 mol/L硫氰酸鉀溶液和15 μL 0.072 mol/L Fe2＋溶液充分混合，于室溫下暗反應20 min。使用紫外分光光度計測定510 nm波長處吸光度，甲醇-丁醇（2∶1，V/V）作空白。以苯氫過氧化物為標準品，繪制標準曲線，根據曲線方程y=8.472x－0.070 9（R2=0.997 9）計算樣品POV。

1.3.12 乳液次級氧化產物的測定

參照Yang Jiayi等[19]的方法并稍作修改。用少量2 mol/L NaOH溶液溶解三氯乙酸后，再用去離子水稀釋，配制10 g/100 mL三氯乙酸溶液；然后用10 g/100 mL三氯乙酸溶液配制1 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液。將1.0 mL乳液樣品與5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液和2 mL 1 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液混合，煮沸30 min，冷卻至室溫。將混合溶液與氯仿按體積比1∶3混合，4 000×g離心15 min，取上清液，用酶標儀測定532 nm波長處吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷為標準品，繪制標準曲線，根據曲線方程y=7.734 4x＋0.032 9（R2=0.998 3）計算樣品丙二醛含量。

1.3.13 乳液光學顯微鏡觀察

用pH 7.0、0.01 mol/L PBS將1 mL乳液樣品稀釋10 倍，取10 μL稀釋后乳液滴于載玻片上，用蓋玻片固定，采用正置顯微成像系統觀察乳液。

1.4 數據統計及分析

2 結果與分析

2.1 納米顆粒粒徑

圖1 納米顆粒粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of nanoparticles

由圖1可知，SPA分散液有2 個明顯的峰，分別位于442 nm和955 nm處，經超聲處理后生成的SNPs粒徑特征峰左移至142 nm附近，表明超聲作用有效地減小了蛋白質顆粒的粒徑。超聲波減小蛋白質顆粒粒徑的作用已得到廣泛報道，如向日葵分離蛋白顆粒[20]和乳清蛋白[21]在超聲作用后顆粒粒徑減小。超聲波能有效分解團聚體和聚集體，并通過破壞非共價相互作用減小顆粒粒徑[22]。Shanmugam等[23]報道，超聲空化效應能夠減小蛋白質顆粒大小，從而提高其溶解性。當EGCG添加量增加到2%時，ESNPs的粒徑減小到58.8 nm，表明在SPA中添加EGCG可以促進超聲后更小顆粒的形成。而EGCG能與食物蛋白相互作用形成大聚集體。Zagury等[24]研究發現，在EGCG存在的情況下，β-乳球蛋白顆粒粒徑至少增大3～4 倍。據報道EGCG與大豆蛋白之間的主要作用力是疏水相互作用[25]，而超聲處理會使蛋白質結構展開，暴露出更多的疏水殘基[26]，這些暴露的殘基促進蛋白之間的疏水相互作用，從而有助于蛋白質聚集體的形成。此外，Lum等[27]報道稱疏水殘基在形成團簇前需排出水分子。同時，EGCG分子具有將水分子從蛋白質表面排出的能力[28]。EGCG可能通過驅逐水分子促進相鄰解折疊蛋白之間的疏水相互作用，從而降低蛋白質聚集的活化能壘。然而蛋白質快速聚集后，疏水殘基定向形成致密的結構，抵抗進一步的聚集。本研究旨在分析EGCG和超聲在減少蛋白質聚集物粒徑大小方面的協同效應，并且Yang Han等[16]報道，粒徑較小的蛋白顆粒能夠在油-水界面迅速吸附到油滴上，從而增加乳液液滴的比表面積，形成更穩定的乳液。EGCG添加量0.8%的ESNPs粒徑最小（50.7 nm），選擇EGCG添加量0.8%的ESNPs制備乳液。

2.2 納米顆粒Zeta電位分析

圖2 納米顆粒Zeta電位Fig. 2 Zeta potential of nanoparticles

從圖2可以看出，所有樣品Zeta電位均為負值，即帶負電氨基酸的數量多于帶正電氨基酸。與SPA相比，SNPs和ESNPs的Zeta電位絕對值有所增加，這是由于超聲處理使蛋白空間結構發生變化，增加了蛋白質表面陰離子基團的暴露。中、高功率下超聲處理可能會增加蛋白質表面電荷，提高蛋白顆粒間的靜電斥力，阻礙聚合，增強蛋白分散體系穩定性，從而提高SNPs和ESNPs的溶解度[29]。此外，隨著EGCG添加量的增加，ESNPs的Zeta電位絕對值增大，在EGCG添加量0.8%達到最大（由17.0增加至34.12），這歸因于帶負電荷的EGCG與蛋白的結合。當Zeta電位絕對值增大，離子間的靜電斥力增大，體系相對穩定，使蛋白以小顆粒形式分散，這與粒徑結果一致。此外，Zeta電位絕對值的增大也可能是由于EGCG與蛋白復合降低了蛋白等電點[30]。相似地，Wei Zihao等[31]研究表明，EGCG與牛乳蛋白共價結合，偶聯物Zeta電位絕對值較牛乳蛋白有所增加。

2.3 納米顆粒的熒光光譜分析

如圖3所示，與SPA對比，SNPs熒光強度顯著提高，這說明超聲處理可引起一定程度的蛋白分子結構展開，從而增加暴露于外部環境的熒光基團數量[26]。這種現象主要是由空化效應引起的流體混合和強剪切力造成的[32]。這與Jambrak等[33]對乳清蛋白的研究結果相似，其發現超聲波處理可以使蛋白分子結構展開，破壞蛋白質分子內疏水鍵，誘導更多蛋白分子內的色氨酸殘基暴露。超聲和EGCG聯合處理后，ESNPs的熒光強度隨EGCG添加量的增加而降低。同樣地，當其他分子如花青素-3-葡萄糖苷與大豆蛋白相互作用時，也觀察到蛋白內源性熒光強度的劑量依賴性猝滅[34]。ESNPs熒光強度的降低可能是分子內相互作用（如氫鍵）導致蛋白質結構緊縮造成[35]。此外，超聲波高剪切作用使蛋白結構部分展開，也使EGCG很容易進入蛋白分子內部與熒光基團作用，導致熒光猝滅[36]。

圖3 納米顆粒熒光光譜Fig. 3 Fluorescence spectra of nanoparticles

2.4 納米顆粒的X射線衍射分析

圖4 納米顆粒X射線衍射圖譜Fig. 4 X-ray diffraction patterns of nanoparticles

如圖4所示，所有樣品均在2θ10°和22°附近表現出強烈的特征衍射峰，這與Chen Jun等[37]對SPI的研究結果一致。SNPs和ESNPs的特征衍射峰強度明顯低于SPA，這說明SNPs和ESNPs的結晶度有所降低。Zhang Yuanhong等[38]也報道了類似的結果，他們觀察到負載姜黃素的大豆蛋白肽納米顆粒的結晶程度明顯降低。與EGCG絡合后蛋白結晶度的降低表明蛋白從晶體結構轉變為非晶態結構。此外，據報道蛋白在2θ約22°處的衍射峰強度能夠代表β-折疊結構的含量[37]。SNPs和ESNPs在2θ約22°的衍射峰強度降低，表明其β-折疊結構含量較SPA降低，這與Zhou Siduo等[39]報道的添加EGCG后SPIβ-折疊含量減少的結果一致。

2.5 乳液粒徑分析

圖5 不同油相體積分數乳液（40 mg/mL）的粒徑Fig. 5 Particle sizes of emulsions with different oil phase volume fractions

由圖5可知，乳液顆粒質量濃度40 mg/mL，不同油相體積分數的ESNPs乳液平均粒徑均小于SPA和SNPs乳液。這說明ESNPs乳液與其他2 種乳液相比更加穩定，EGCG與超聲共同作用制備的納米顆粒可以明顯改善乳液的穩定性。這一結果也與納米顆粒的粒徑結果一致。Karnaukhova等[40]研究表明，添加適量的小分子物質可以顯著改善大分子蛋白乳液的液滴粒徑。Li Dan等[41]研究表明，兒茶素的加入有效改善了EGCG-米糠蛋白復合物乳液粒徑，明顯小于米糠蛋白乳液。此外，隨著油相體積分數的增加，乳液液滴粒徑增大，最高達到13.6 μm（油相體積分數60% SPA組），這可能是由于一定質量濃度的納米粒子只能穩定有限的油-水界面。隨著油相體積分數的增加，需要在較小的總界面面積下形成較大的液滴，以實現所有油滴表面的充分覆蓋[16]。

2.6 乳液的乳化性和乳化穩定性分析

圖6 乳液（40 mg/mL）的乳化性及乳化穩定性Fig. 6 Emulsifying activity index and emulsion stability index of emulsions

如圖6所示，SPA乳液EAI為（46.6±4.27）m2/g，超聲處理后，SNPs乳液EAI顯著增加至（93.5±1.65）m2/g（P＜0.05），表明超聲處理促進了蛋白與油脂或蛋白與蛋白之間的相互作用。與SPA乳液相比，超聲處理使SNPs和ESNPs乳液的ESI分別增長至約2 倍和3 倍，說明超聲處理可提高乳液穩定性。這與Shen Xue等[42]的研究結果一致，他們發現超聲處理提高了乳清蛋白的ESI。Amiri等[43]發現不同超聲功率（100～300 W）處理30 min后，牛肉肌原纖維蛋白的EAI和ESI均有所提高。ESNPs乳液的EAI和ESI均高于SPA和SNPs乳液，說明EGCG的加入和超聲聯合處理有助于提高SPA的乳化能力。Yan Shizhang等[44]研究表明經EGCG共價改性后，SPI乳化性能得到明顯改善。

2.7 乳液的氧化穩定性分析

圖7 乳液（40 mg/mL）的POV（A）和丙二醛濃度（B）Fig. 7 Changes in peroxide value and malondialdehydem concentration of emulsions as a function of storage time

由圖7可知，質量濃度40 mg/mL、油相體積分數60%的SPA、SNPs、ESNPs乳液于60 ℃貯藏7 d后，3 種乳液POV均隨貯藏時間的延長而增加，與SPA乳液相比，貯藏期間SNPs和ESNPs穩定乳液POV顯著較低（P＜0.05），表明它們的氧化速率較慢。與初級氧化結果一致，貯藏期間SPA穩定乳液的丙二醛濃度迅速增加，第7天時丙二醛濃度較初始水平增加了14 倍。與SPA乳液相比，ESNPs穩定乳液的丙二醛濃度在整個貯藏期都較低，且增加較為緩慢，表明EGCG結合超聲處理抑制了油脂氧化，僅超聲處理的SNPs乳液的丙二醛含量雖然也低于SPA乳液，但其脂質氧化的抑制效果不如ESNPs乳液。EGCG與SPA結合可以清除自由基或使促氧化劑（如油-水界面的過渡金屬離子）失活，從而阻止脂質分解為烷氧基和過氧自由基[45]。此外，這些高活性的自由基與不飽和脂肪酸中的氫結合使其活性受到抑制，從而延緩脂質的氧化[46]。此外，有研究[47]表明乳液的氧化穩定性與顆粒大小密切相關。因此，SPA乳液對脂質氧化的敏感性較SNPs和ESNPs高，這很大程度歸因于SPA顆粒粒徑更大、更不均勻。同時，ESNPs構成致密的界面膜阻止促氧化劑的滲透和擴散，延緩了脂質與促氧化劑的相互接觸，從而有效抵抗脂質的次級氧化。Phoon等[48]也認為，交聯的界面蛋白層可能是阻止氧分子轉移的有效物理屏障，從而抑制了油脂氧化。Fan Yuting等[49]研究發現，乳球蛋白-EGCG共軛物有助于提高包封油脂或保健食品的氧化穩定性。總之，EGCG結合超聲處理的ESNPs不僅顯著改善了乳液的物理穩定性，而且阻礙了油脂氧化。

3 結 論

與SPA相比，SNPs和ESNPs粒徑減小，隨EGCG添加量的增加，ESNPs粒徑分布向左側移動，Zeta電位絕對值先增大后趨于平緩。EGCG添加量0.80%的ESNPs粒徑最小、Zeta電位絕對值最大。熒光光譜顯示，與SPA相比，SNPs熒光強度增強，而ESNPs熒光強度減弱，且呈EGCG劑量依賴性猝滅。X射線衍射圖顯示，SPA、SNPs和ESNPs均在2θ10°和22°附近有特征衍射峰，表明SNPs和ESNPs的結晶度較SPA降低，由晶態向非晶態轉變。此外，隨油相體積分數的增加，SPA、SNPs、ESNPs乳液粒徑均逐漸增大。SPA乳液粒徑最大，其次是SNPs，ESNPs乳液粒徑最小。氧化穩定性結果顯示，ESNPs乳液的脂質氧化分解被有效抑制，初級氧化產物和次級氧化產物含量均少于SPA和SNPs乳液。基于這些結果，ESNPs具有作為優異乳液穩定劑的潛力。