甲酸對釀酒酵母的細胞毒性

曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，安佳星，佀再勇，龍秀鋒，伍時華，易 弋

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

燃料乙醇因其具有清潔、可持續、可再生等特性，被認為是目前取代化石燃料的最有潛力的可再生能源之一[1]。木質纖維素是地球上貯量最為豐富、分布廣泛且價格低廉的可再生資源，通過其生產燃料乙醇不僅能滿足當前的能源需求，而且能有效減少環境污染[2]。木質纖維素由纖維素、半纖維素和木質素3 種物質組成，這3 種組分之間由共價鍵和氫鍵相互作用而緊密結合。利用木質纖維素原料進行乙醇發酵需要對其進行預處理，破壞纖維素復雜結構，但在預處理過程中會產生對細胞有毒害作用的抑制物。基于這些細胞抑制物的來源，通常將這些抑制物分為3 大類：糖降解產生的糠醛和5-羥甲基糠醛等呋喃類化合物，木質素分解產生的兒茶酚、丁香醛等酚類化合物，以及甲酸和乙酸等弱酸類化合物[3-4]。這些抑制物會對酵母細胞的生長、代謝和乙醇生產產生負面影響[5]。甲酸是木質纖維素原料水解液中一種常見的弱酸類抑制物，由呋喃類化合物進一步降解形成。在水解液中常見的幾種弱酸，如甲酸、乙酸、乙酰丙酸，其中雖然甲酸的濃度比較低，但其對細胞抑制能力最強[6-7]。Li Yuncheng等[8]研究表明在相同濃度（30 mmol/L）弱酸脅迫下，甲酸對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞的抑制作用強于乙酸和乙酰丙酸。甲酸分子質量低且pKa值較小，因此被認為是木質纖維素水解產物中毒性最強的弱酸[9-10]。Larsson等[11]研究表明甲酸的毒性強于乙酸和乙酰丙酸是因為甲酸具有更低的pKa值和解離程度小引起。

為探究甲酸對釀酒酵母的毒性機理，通過測定甲酸處理前后釀酒酵母的生長情況、葡萄糖消耗、乙醇的含量、細胞膜通透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和己糖激酶（hexokinase，HK）活力，并結合掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，FTIR）進行分析。本研究旨在了解甲酸對酵母細胞的生理毒性機制，為進一步研究提高釀酒酵母對木質纖維素水解液抑制物耐受性的方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

釀酒酵母GGSF16由廣西科技大學微生物研究所提供。

甲酸、三氯乙酸（均為分析純） 西隴科學股份有限公司；戊二醛（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；HK活性檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機 德國CHRIST公司；飛納phenom臺式SEM 復納科學儀器（上海）有限公司；Frontier FTIR儀 興和儀器（上海）有限公司；UV-8000S紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SZT-15T手動粉末壓片機 天津市眾拓科技發展有限公司；JY91-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZWYR-2402疊式恒溫調速搖床上海智誠分析儀器制造有限公司；H2100R低溫高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基

種子培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L；酵母膏蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone extrose，YEPD）培養基：葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L；發酵培養基：葡萄糖160 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121 ℃滅菌20 min，pH值自然。

1.3.2 酵母細胞菌懸液的制備

從斜面試管中挑取1～2 環釀酒酵母GGSF16接種到種子培養基中，在30 ℃、150 r/min搖床中培養14 h，采用血球計數對酵母細胞進行計數并稀釋使其菌懸液濃度約為1×108CFU/mL。

1.3.3 甲酸對酵母細胞生長的影響

將酵母菌懸液按照10%接種量接入到YEPD培養基中，分別吸取一定量40 g/L的甲酸母液于培養基中，將甲酸配制成質量濃度分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L，以未添加甲酸的菌液作為對照組，添加甲酸的菌液為處理組，30 ℃、150 r/min搖床中進行培養，每隔2 h取樣，在600 nm波長處測定光密度，以時間為橫坐標、光密度為縱坐標繪制生長曲線，并采用次甲基藍染色法測定細胞死亡率[12]。每個樣品進行3 次生物學重復。

1.3.4 甲酸對酵母乙醇發酵的影響

根據1.3.3節酵母細胞的生長情況，選擇甲酸質量濃度1.8 g/L做后續實驗。按照10%接種量將酵母細胞菌懸液接入到新鮮種子培養基中培養6 h后取30 mL菌液離心棄上清液，并用無菌水稀釋至合適體積并振蕩混勻，再以10%接種量將3 mL濃縮種子液加入至300 mL發酵培養基中，初始酵母細胞數為3.7×107CFU/mL。將甲酸添加到發酵培養基中使其終質量濃度為1.8 g/L作為處理組，以未添加甲酸的菌液作為對照組，在30 ℃、150 r/min搖床中培養24 h，每隔2 h取樣，并用高效液相色譜儀和氣相色譜儀分別測定葡萄糖和乙醇含量。液相色譜條件：Alltima Amino色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-超純水（80∶20，V/V）的混合液作為流動相，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。氣相色譜條件：色譜柱為TM-930（25 m×0.53 mm，1 μm）；初始溫度40 ℃，以5 ℃/min速率升至80 ℃，保持2 min，再以10 ℃速率升至150 ℃，進樣量0.5 μL。每個樣品進行3 次生物學重復。

1.3.5 甲酸對酵母細胞膜通透性的影響

按照10%接種量將酵母細胞菌懸液接入到250 mL YEPD培養基中培養8 h，添加甲酸到YEPD培養基中使其終質量濃度為1.8 g/L作為處理組，以未添加甲酸的為對照組，在30 ℃、150 r/min搖床中培養6 h，每隔2 h取樣。取5 mL發酵液，在80 ℃水浴鍋中滅酶5 min，然后取經水浴后的發酵液于3 000 r/min離心20 min，將上清液分別標記置于4 ℃冰箱保存。在260、280 nm波長處測定測定核酸、蛋白質的光密度，并記錄好實驗數據[13-14]。每個樣品進行3 次生物學重復。

1.3.6 甲酸對酵母細胞MDA含量的影響

按1.3.5節培養方法，MDA含量的測定參考Howlett等[15]方法。離心收集酵母細胞，經無菌水洗滌3 次后棄上清液，加入1 mL無菌ddH2O，重懸酵母細胞，另加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，充分混勻并封口后于95～100 ℃水浴煮沸20 min，冷卻后10 000 r/min離心5 min，取上清液分別測定450、532、600 nm波長處吸光度（A）。測定細胞干質量，根據式（1）、（2）計算MDA濃度與含量。每個樣品進行3 次生物學重復。

式中：V為反應體系溶液體積/mL；W為樣品質量/g。

1.3.7 甲酸對酵母細胞形態的影響

按照1.3.5節培養方法，在30 ℃、150 r/min搖床中培養4 h，取發酵液8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，每次靜置10 min，將菌體固定于體積分數2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃過夜固定，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體，以20%、50%、70%、80%、100%的乙醇按照順序依次洗滌，每個濃度處理10 min，8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，最后使用真空冷凍干溶液燥機干燥，噴金后在SEM下觀察、拍照。

1.3.8 FTIR分析

按照1.3.5節培養方法，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞3 次，冷凍干燥，本實驗采用溴化鉀壓片法[16]。將凍干的酵母菌體與溴化鉀按1∶20的質量比混合，然后用瑪瑙研缽研成均勻粉末狀。掃描條件設置為光譜范圍400～4 000 cm－1、分辨率4 cm－1，采用溴化鉀作為空白對照，每個樣品在相同條件下重復3 次。

1.3.9 甲酸對酵母細胞HK活力的影響

按照1.3.5節培養方法，在30 ℃、150 r/min搖床中培養1 h，離心收集菌體，超聲波破碎（功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復30 次），8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集上清液，置冰上待測。采用Solarbio公司HK試劑盒檢測HK活力，每個樣品進行3 次生物學重復。酶活性單位的定義（U/104cell）：每1萬 個細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為1 個酶活力單位。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用GraphPad Prism 8.1軟件（單因素方差分析）和Origin 9.5軟件對數據進行圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 甲酸對酵母細胞生長的影響

由圖1A可知，不同質量濃度甲酸對酵母細胞的生長抑制不同，且隨著質量濃度的增加抑制作用加強。對照組在培養2 h開始進入對數期，6 h進入對數中期，8 h進入穩定期；添加1.4 g/L甲酸處理組在培養10 h進入穩定期，與對照組相比滯后了2 h；添加1.6 g/L甲酸處理組發現酵母細胞生長緩慢，與對照組相比，延滯期和對數期都延長了2 h，穩定期滯后了4 h；添加1.8 g/L甲酸處理組在培養6 h進入對數期，14 h進入穩定期，與對照組相比，穩定期滯后6 h。而在整個細胞生長過程中，1.8 g/L甲酸處理組的死亡率都比對照組高（圖1B），尤其是在0～2 h的延滯期細胞死亡率更明顯；添加2.0 g/L甲酸處理組，釀酒酵母細胞的生長完全被抑制。綜上所述，甲酸對酵母細胞的生長繁殖具有一定的毒害作用。為保證后續實驗的研究，選擇質量濃度為1.8 g/L的甲酸作為處理組。

圖1 甲酸對酵母細胞生長的影響Fig. 1 Effect of formic acid on the growth of yeast cells

2.2 甲酸對酵母乙醇發酵過程的影響

酵母細胞能夠通過葡萄糖發酵生產乙醇，而甲酸的添加會抑制酵母細胞的生長，從而影響乙醇的生成。由圖2可知，對照組在6 h后開始快速消耗葡萄糖，16 h葡萄糖消耗完全。而1.8 g/L甲酸處理在發酵前期抑制了酵母細胞對葡萄糖的利用，在10 h才開始消耗糖，與對照組相比葡萄糖消耗延長了4 h，在20 h葡萄糖才基本消耗完，延長了細胞發酵的周期，且甲酸處理組乙醇生成量顯著低于對照組。說明1.8 g/L甲酸處理組在發酵前期抑制酵母細胞對糖的利用，乙醇發酵速率緩慢，在發酵中后期，酵母可能會對甲酸產生耐性，保持較高的存活率，進一步促進了對糖的利用，但甲酸的添加明顯延長了酵母細胞發酵的周期，降低了乙醇產量。

圖2 甲酸對酵母細胞乙醇發酵過程的影響Fig. 2 Effect of formic acid on alcohol fermentation characteristics of yeast cells

2.3 甲酸對釀酒酵母細胞膜通透性的影響

細胞膜是隔離胞內外物質的天然屏障，細胞膜通透性的增強會導致胞內重要物質泄露，從而使細胞失去活性[17]。因此，可以通過檢測菌液在260 nm和280 nm波長處的光密度分析其對細胞膜的破壞程度[18]。由圖3可知，甲酸處理后的酵母細胞的蛋白質和核酸釋放量明顯增加，OD260nm的增加比OD280nm更為明顯，且隨著甲酸處理時間的延長，胞外核酸和蛋白質的含量隨之增加，且與對照組相比，核酸和蛋白質分別增加到1.4 倍和1.67 倍，這與藍蔚青等[19]研究ε-聚賴氨酸使腐生葡萄球菌菌液中胞外核酸含量的增加趨勢結論相似。由此推測甲酸與酵母細胞接觸后，破壞了酵母細胞膜，使得細胞膜通透性增加，導致胞內物質外泄，從而使釀酒酵母的活性較低，甚至死亡。

圖3 甲酸對酵母細胞膜通透性的影響Fig. 3 Effect of formic acid on cell membrane permeability of yeast cells

2.4 甲酸對酵母細胞MDA含量的影響

MDA是生物體內脂質與自由基發生過氧化反應的產物，其含量可以一定程度上反映酵母細胞受脅迫損傷的程度，也能反映細胞膜所受傷害程度[20]。由圖4可以看出，酵母細胞經甲酸脅迫后MDA含量隨著甲酸處理時間的延長而逐漸增加。甲酸處理的第2小時，酵母細胞內MDA含量增加緩慢，隨后4 h，MDA含量顯著升高，與對照組相比，分別增加到3.7 倍和5.3 倍。表明短時間內甲酸不會對酵母細胞造成嚴重的氧化損傷，這可能是酵母對逆境的適應性反應。而隨著時間的延長，細胞膜脂質過氧化程度加劇，MDA含量升高，對酵母細胞造成氧化損傷，進一步加速了細胞的死亡。這與李函彤等[21]研究不同種類的硫對酵母富鉻以及體內氧化應激影響的結論相似。

圖4 甲酸對酵母細胞MDA含量的影響Fig. 4 Effect of formic acid on MDA content of yeast cells

2.5 甲酸對酵母細胞形態的影響

圖5 甲酸處理前后SEM圖Fig. 5 SEM images of yeast cells before and after formic acid treatment

由圖5可以看出，對照組酵母表面光滑飽滿，外形呈橢圓或圓形，細胞形態整齊且健壯，有完整的細胞壁以及光滑的細胞膜結構，酵母細胞生命力旺盛（圖5A），而經過甲酸處理后細胞遭到了明顯破壞，與對照組相比酵母細胞表面變得粗糙，出現空洞，邊緣產生皺褶，細胞壁塌陷，細胞與細胞之間彼此粘黏現象（圖5B），這可能是細胞壁和細胞膜被破損，細胞內容物泄露使它們粘連在一起，因此，從SEM圖像中可以明顯看出甲酸對釀酒酵母細胞壁有明顯破壞作用，對細胞膜也有一定影響，從而使酵母細胞失去了細胞壁的保護，細胞正常生理代謝與物質能量代謝受阻，導致菌體生理活性受到抑制，進而導致細胞損傷與死亡。

2.6 FTIR分析

研究表明，酵母細胞壁主要由β-葡聚糖、甘露糖蛋白、少量的幾丁質和脂類組成，對維持細胞形態和細胞間識別具有重要作用[22]。這些物質能夠提供大量的活性基團，且由這些基團產生的伸縮、彎曲和變形振動均可以在FTIR中產生明顯的吸收峰[23]。在酵母菌的光譜圖中，表征蛋白質最重要的譜帶是酰胺帶，其中位于1 650 cm－1處的酰胺I帶是由C=O的伸縮振動、N—H的彎曲振動形成，它表明了釀酒酵母中蛋白質的二級結構以α-螺旋為主[24]。1 540 cm－1處的酰胺II帶則是由N—H的彎曲振動和C—N的伸縮振動引起，1 452 cm－1處的特征峰是由于CH2的剪式振動、CH3的非對稱彎曲振動引起[25]。位于1 240 cm－1處的酰胺III帶可能是由C—N彎曲振動、—COOH中C—O的伸縮振動和P=O的變形振動導致，代表磷酸二酯鍵的不對稱拉伸，與磷脂雙分子層有關[26]。位于1 080 cm－1和915 cm－1左右的吸收峰分別代表酵母的RNA、DNA或細胞壁中存在的碳水化合物和多糖環鍵[27]。位于810 cm－1左右處的峰位是釀酒酵母表面醛糖酸的特征峰，位于540～580 cm－1處的峰位是的剪式振動產生[24]。位于3 418 cm－1左右的峰位是由于分子間、分子內氫鍵或者KBr吸收水產生的—OH振動，3 307 cm－1處吸收峰由于幾丁質中的—OH和仲胺中的—NH的伸縮振動引起，而位于3 100～2 800 cm－1處的吸收峰由于脂肪酸中—CH基團的反對稱振動引起，代表脂質官能團[28]。

圖6 為甲酸處理前后的酵母細胞FTIR。蛋白質是構成細胞膜和細胞壁主要組成成分，在甲酸處理后發現酰胺I帶的紅移（1 651.3/1 650.3 cm－1）和酰胺II帶的藍移（1 542.9/1 545.4 cm－1），表明可能蛋白質肽鏈上O原子和N原子發生了變化，推測甲酸脅迫可能引起酵母細胞蛋白質變性。另外，酰胺III帶（1 243.3/1 242.4 cm－1）、（1 081.5/1 080.7 cm－1）峰位均產生了紅移，可能是甲酸處理后破壞細胞膜的磷脂雙分子層，細胞膜的通透性發生了改變并釋放了部分核酸和蛋白質，這與前面實驗結果一致。在3 307、3 002.6 cm－1和2 928.6 cm－1處峰位明顯增加，表明甲酸改變了細胞壁中幾丁質的結構，且對酵母細胞膜的脂質產生了破壞。在914.2 cm－1處的峰位增強，表明甲酸改變了釀酒酵母表面的多糖羥基骨架，進而改變酵母細胞壁的結構。代表醛糖酸的特征峰在812.4 cm－1也發生了較大的變化，表明酵母細胞表面的物質可能發生了很大的化學變化[29]。因此可以看出甲酸通過改變蛋白質、多糖、脂質和幾丁質的結構對酵母細胞壁和細胞膜進行破壞，從而導致了細胞的死亡。

圖6 甲酸處理前后FTIR圖Fig. 6 Infrared spectra of yeast cells before and after formic acid treatment

2.7 甲酸對酵母細胞HK活力的影響

HK廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是葡萄糖分解過程中的第一個關鍵酶，催化葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，在真菌的糖代謝中發揮重要作用。由圖7可知，經甲酸處理后，HK活力明顯高于對照組（P＜0.05），由（0.07±0.003）U/104cell上升到了（0.277±0.005）U/104cell（P＜0.05），這表明甲酸處理后增加了酵母細胞內HK活力，加快了對葡萄糖的分解代謝，進而為酵母細胞抵抗甲酸的損傷提供了能量。

圖7 甲酸對酵母細胞HK活力的影響Fig. 7 Effect of formic acid on hexokinase activity of yeast cells

3 討 論

木質纖維素水解后會產生一些細胞抑制物，這些抑制物會對細胞的生長代謝造成一定毒害作用，從而降低后續乙醇發酵的產率[30-31]。甲酸是木質纖維素原料水解產生的毒害副產物之一，主要由糠醛和5-羥甲基糠醛產生[32]，在木質纖維素乙醇發酵過程中對酵母細胞的生長和代謝都具有較強抑制作用[33]。本研究發現，添加1.8 g/L甲酸能夠明顯抑制酵母細胞的生長和乙醇發酵時間，可以破壞酵母的細胞壁，改變細胞膜的通透性，使得細胞內容物外漏，胞內MDA含量和HK活力顯著上升（P＜0.05），從而影響了酵母細胞正常生長，甚至導致其死亡。

有些外界因素能夠破壞細胞膜的通透性，從而干擾細胞正常的物質運輸[34]。本實驗發現甲酸處理后的酵母細胞的蛋白質和核酸釋放量明顯增加（P＜0.05），鞏林林等[35]研究分析了有機溶劑乙腈對酵母菌細胞膜透性的影響，結果發現面包酵母經過20%經過20%乙腈處理后對細胞膜造成一定損傷，OD260nm值和OD280nm值均隨時間的延長而增加；李永紅等[36]通過對紅酵母細胞通透性的研究，發現添加甲苯能提高紅酵母細胞通透性。此外，周倩倩等[37]研究丁香酚對腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的抑菌機制，結果也發現丁香酚處理后細胞膜遭到破壞，使細胞外OD280nm值和OD260nm值的水平上升。因此，推測甲酸處理后改變了酵母細胞膜通透性，細胞內物質流失，最終使酵母細胞無法正常進行生命活動而死亡。吳麗華等[38]研究發現，經0.4 mmol/L和0.6 mmol/L亞砷酸鈉處理后，細胞膜脂質過氧化程度加劇，MDA含量在釀酒酵母細胞內顯著提高。Ji Zhihua等[39]研究了不同濃度四氯雙酚A誘導酵母細胞毒性，經5 μmol/L四氯雙酚A處理后酵母細胞中MDA水平增加，促進了細胞膜的損傷和膜通透性的增強。本研究經甲酸處理后酵母細胞內MDA含量隨著時間的延長逐漸增加，說明甲酸破壞了細胞膜，使得膜的通透性增大，脂質過氧化程度加劇，引起酵母細胞氧化損傷，進一步加速了細胞的死亡。侯穎等[40]通過研究發現經致死濃度聚賴氨酸處理后酵母細胞表面粗糙，出現明顯凹陷和細微凸起，細胞膜造成嚴重損傷。薄濤等[41]研究發現當釀酒酵母經過500 μg/mLε-聚-L-賴氨酸處理后，與對照組相比細胞膜表面變的粗糙，出現明顯孔洞等現象。在SEM觀察下，經甲酸處理4 h后酵母細胞表面變得粗糙、邊緣產生皺褶、部分細胞壁塌陷，且細胞與細胞之間彼此粘黏現象；因此，推測甲酸破壞了酵母細胞膜和細胞壁，以致細胞失去了保護而出現死亡。

FTIR是一種基于化合物中官能團和極性鍵振動的結構分析技術[42]，其特點是操作簡單、快速及靈敏度高[43]，近年來已廣泛應用于大分子化合物結構分析以及蛋白質的二級結構解析，是獲取分子結構信息的有力工具[44]。本研究發現釀酒酵母經甲酸處理前后FTIR圖部分峰發生了變化，結果表明與之相關的官能團包括氨基、羥基，而這些官能團主要存在于釀酒酵母細胞壁上的蛋白質和糖類物質，說明酵母細胞的結構進一步遭到破壞。HK作為糖酵解過程中第一個關鍵酶，其活性大小直接與胞內能量代謝快慢有關，在真菌的糖代謝中發揮重要作用[45]。本研究中，甲酸處理后酵母細胞內HK活性相比對照組提高到3.95 倍，由此說明甲酸脅迫在一定程度上加快了葡萄糖代謝，促進了ATP的合成，為酵母細胞抵抗甲酸損傷提供了充足的保障。

4 結 論

通過測定不同質量濃度甲酸對釀酒酵母生長代謝的影響，結果發現添加1.8 g/L甲酸能夠明顯抑制酵母細胞的生長，降低了乙醇產量，并且延長了葡萄糖消耗和酵母細胞乙醇發酵的周期；甲酸處理后改變了酵母細胞膜通透性，MDA含量增加，使得細胞內溶物發生泄露，最終導致酵母細胞的死亡。同時，釀酒酵母通過調節糖酵解中HK活力，為細胞提供充足的ATP抵抗脅迫；從甲酸處理前后的SEM圖像可看出原來光滑的酵母菌體表面出現空洞、大量皺褶以及細胞之間彼此粘黏現象，而通過FTIR分析結果進一步發現甲酸可以改變蛋白質、糖類等分子成分的官能團結構，對酵母細胞的細胞壁和細胞膜進行破壞，使細胞失去了保護作用而死亡。本研究為提高釀酒酵母酸類物質耐受性的方法提供了理論依據。