利用RNAi技術研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010表達對檸檬烯轉化生成α-松油醇的影響

張璐璐，范 剛，李 曉，任婧楠，潘思軼，黃 文，何 進

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.華中農業大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070）

隨著人們健康意識的增強，天然香料的應用日益廣泛，而通過微生物生物轉化作用生產的香料已經被認為是天然的[1]。微生物轉化能夠將品質不高的檸檬烯轉化生成α-松油醇等香氣更濃、應用價值更高的香料[2-5]，然而目前微生物轉化檸檬烯生產α-松油醇過程中的關鍵酶或基因還不清楚，轉化途徑和轉化機制仍不明確，生成的產物成分復雜，所得到的轉化產物產率仍然很低。因此，檸檬烯微生物轉化的分子機制研究對香精香料的發展以及工業化生產有重要的推動作用。

在本實驗室前期研究中，以指狀青霉（Penicillium digitatum）DSM62840為研究對象，通過基因組測序，轉錄組分析以及蛋白分離純化和生物信息學分析等手段挖掘檸檬烯微生物轉化生成α-松油醇過程中的關鍵基因。其中通過基因組和轉錄組分析，篩選得到一個候選基因PDIDSM_85260，該基因在檸檬烯轉化的過程中上調了3 000多倍[6]。對該基因進行BLAST分析，發現該基因被注釋為假定蛋白，含有一個GAL4-like Zn2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain（GAL4）和一個fungal transcription factor regulatory middle homology region（fungal_TF_MHR）。在蛋白水平上，PDIDSM_85260與卡門培爾青霉（Penicillium camemberti）FM013中的真菌轉錄調控蛋白具有高度相似性（相似度95%）。以上結果說明基因PDIDSM_85260可能是一個轉錄因子。研究表明大多數鋅指蛋白是參與碳/氮源的利用或氨基酸/次級代謝物的生物合成，比如橘青霉菌（P. citrinum）中參與美伐他汀生物合成的MlcR[7]、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）中參與黃曲霉毒素生物合成的AflR[8]、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中參與半乳糖代謝的Gal4[9]以及構巢曲霉菌（A. nidulans）中與硝酸鹽利用有關的NirA[10]。基因PDIDSM_85260的高表達說明它在檸檬烯生物轉化過程中可能起重要作用。此外，通過超速離心、30%～60%硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析對指狀青霉DSM62840轉化檸檬烯生成α-松油醇過程中的關鍵酶進行分離純化，電泳結果顯示在分子質量約為50 kDa處有一條明顯的蛋白條帶。經過質譜鑒定，該條帶中的蛋白可能是二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD，PDIDSM_08010），推測其可能參與調控檸檬烯的微生物轉化過程（文章未發表）。

為了進一步驗證基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010在檸檬烯微生物轉化過程中的功能，本研究利用RNAi技術構建PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的干涉載體pCAMBIA1303-TrpC-HygrogpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1，經農桿菌介導轉化到指狀青霉DSM62840中。篩選得到陽性轉化子之后，通過實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）測定基因的表達量以獲得干涉菌株，比較干涉菌株與野生型菌株轉化檸檬烯的能力，以研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010在檸檬烯微生物轉化過程中的作用，這不僅將為指狀青霉DSM62840生物轉化檸檬烯生產α-松油醇的研究提供一定的參考，還為后續其他基因的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種、質粒與試劑

指狀青霉DSM62840購自德國微生物菌種保藏中心；質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP和pFC332淼靈質粒平臺；Trans1-T1 phage resistant感受態細胞北京全式金生物技術有限公司；農桿菌AGL-1 上海唯地生物技術公司。

R-(＋)-檸檬烯 東京化工有限公司；R-(＋)-α-松油醇美國Sigma公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、潮霉素（hygromycin，Hyg）、利福平（rifampicin，Rif）、頭孢噻肟霉素（cefotaxime，Cefo）、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS） 美國Sigma-Aldrich公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、質粒小抽提試劑盒（離心柱型） 天根生化科技有限公司；SYBR Green Premix ProTaqHS qPCR Kit、Evo M-MLV RT Kit艾科瑞生物工程有限公司。

1.1.2 培養基

麥芽酵母肉湯（malt yeast brot，MYB）培養基：酵母提取物3 g/L，麥芽提取物20 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L。

Luria-Bertani（LB）培養基：蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，NaCl 10 g/L。

強化分解代謝阻抑肉湯（super optimal broth with catabolite repression，SOC）培養基：在950 mL水中添加蛋白胨20 g、酵母提取物5 g和NaCl 0.5 g，使其完全溶解之后添加10 mL 250 mmol/L KCl溶液，調節pH 7.0，然后定容至1 L，高壓滅菌。在使用之前在添加20 mL 1 mol/L葡萄糖溶液（過濾除菌）。

基本培養基（minimal medium，MM）：K-buffer 10 mL，M-N buffer 20 mL，20%葡萄糖10 mL，0.01% FeSO410 mL，20% (NH4)2SO42.5 mL，1%CaCl2·2H2O 1 mL，補H2O至1 L，調節pH 6.7～7.0。

誘導培養基（induction medium，IM）：K-buffer 10 mL，M-N buffer 20 mL，20%葡萄糖5 mL，0.01% FeSO410 mL，20% (NH4)2SO42.5 mL，1%CaCl2·2H2O 1 mL，50%甘油10 mL，MES 7.808 g，補H2O至1 L，調節pH 5.6。

共培養誘導培養基（cocultivation induction medium，Co-IM）：K-buffer 10 mL，M-N buffer 20 mL，20%葡萄糖2.5 mL，0.01% FeSO410 mL，20% (NH4)2SO42.5 mL，l% CaCl2·2H2O 1 mL，50%甘油10 mL，MES 7.808 g，瓊脂20 g，補H2O至1 L，調節pH 5.6。

K-buffer：109 g K2HPO4溶于500 mL水中，用磷酸調節pH 4.9，滅菌后室溫保存；M-N buffer：15 g MgSO4·7H2O和7.5 g NaCl溶于500 mL水中，滅菌后室溫保存。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；6890N-5975B氣相色譜-質譜聯用儀美國Agilent公司；THZ-C-1全溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ViiA7 System熒光定量PCR儀 美國ABI公司；凝膠成像系統、PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的生物信息學分析

基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的氨基酸序列來源于指狀青霉DSM62840基因組數據（指狀青霉DSM62840基因組數據已經被上傳至DDBJ/ENA/GenBank，收錄號為JAAQRF000000000）。蛋白質的理化性質分析通過在線程序Pro Param（http://web.expasy.org/protparam/）預測分析；蛋白質的二級結構利用在線程序SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進行預測分析；蛋白質三級結構利用在線程序SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進行預測分析[11]。

1.3.2 沉默載體的構建

1.3.2.1 目的基因RNAi序列和TEF1啟動子的擴增

以TEF1F/R為引物、pFC332為模版，進行PCR擴增獲得pFC332上的TEF1啟動子序列。以85260 F/R和08010 F/R為引物，指狀青霉DSM62840基因組DNA為模版[12]，進行PCR擴增獲得基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列。引物序列見表1。PCR擴增體系：Q5 0.5 μL，Q5 Buffer 10 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，引物各2 μL，H2O 33 μL，模板（1 ng/μL 質粒，基因組為50 ng/μL）0.5 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s（循環5 次）；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s（循環30 次）；72 ℃延伸5 min。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

表1 載體構建及real-time PCR驗證所用引物序列Table 1 Primer sequences used for vector construction and real-time PCR verification

1.3.2.2 質粒雙酶切處理

pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD使用50 μg/mL Kan抗性的LB培養基進行培養，然后使用質粒小抽提試劑盒進行質粒提取。使用EcoRI和BstEII對質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD進行雙酶切處理，37 ℃完全酶切3 h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，并對酶切產物進行切膠回收。酶切體系：10×Buffer 5 μL，EcoRI 1.5 μL，BstEII 1.5 μL，載體37 μL，H2O 5 μL。

1.3.2.3 重組反應

將目的基因RNAi序列、TEF1啟動子的PCR回收產物與質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD的酶切片段進行重組反應，重組體系：pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD酶切產物0.5 μL、TEF1啟動子1 μL、85620/08010 PCR產物片段1 μL、Clonexpress II 1 μL、Buffer 2 μL、H2O 4.5 μL。將連接體系于37 ℃反應30 min后立刻放置在冰上，隨后進行轉化反應。將連接產物熱激轉入Trans1-T1 phage resistant感受態細胞，挑選陽性轉化子進行菌落PCR驗證及測序，挑選正確的陽性轉化子接種于LB培養基中進行擴大培養，提取質粒pCAMBIA1303-TrpCHygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-HygrogpdA-08010-TEF1。

1.3.3 農桿菌介導的遺傳轉化

將質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1熱激轉入農桿菌AGL-1感受態細胞[13-14]，挑選陽性轉化子進行菌落PCR驗證及測序，篩選陽性克隆。

挑取驗證成功的農桿菌單菌落于1 mL LB（含有50 μg/mL Kan和20 μg/mL Rif）培養液中，200 r/min、28 ℃培養24 h。然后將農桿菌菌液加入到100 mL MM（含有50 μg/mL Kan）液體培養基中，200 r/min、28 ℃培養48 h。收集菌液，5 000×g、4 ℃離心10 min，去上清液后，用等體積IM培養液重懸，并用IM稀釋至OD600nm為0.4，添加AS至終濃度為200 μmol/L，于200 r/min、28 ℃培養至OD600nm為0.8。

指狀青霉菌絲在PDA固體培養基上活化后，用打孔器打取直徑相同的菌塊，浸入上述IM農桿菌菌液孵育20 min，每隔10 min輕輕搖勻一次。之后，將菌塊用滅菌濾紙稍微吸干菌液后，轉入含有200 μmol/L AS的Co-IM固體培養基中，28 ℃正置培養。2 d后，將菌絲塊從共培養基上挑取下來，浸入含有400 μg/mL Cefo無菌水中孵育20 min，每隔10 min輕輕搖勻一次。菌塊用滅菌濾紙稍微吸干水分后，轉移至含有100 μg/mL Hyg和400 μg/mL Cefo的PDA固體培養基上，28 ℃培養7 d，觀察菌絲生長情況。

將上步獲得的新生菌絲用2 mg/mL纖維素酶消化2 h，然后再接種于新的含有100 μg/mL Hyg和400 μg/mL Cefo的PDA固體培養基上，進行第2次篩選。5～7 d后，得到的再生菌絲即為轉化子。

1.3.4 干涉轉化子的驗證

提取轉化子的RNA，以野生型菌株為對照，進行real-time PCR驗證實驗。使用Trizol法提取RNA[15]，cDNA的合成以及real-time PCR實驗參照Zhang Lulu等[6]的方法。每個基因均設置3 個技術重復和3 個生物學重復。β-actin作為內參基因。real-time PCR引物見表1。

1.3.5 干涉菌株的微生物轉化實驗

用1～2 周的野生型菌株指狀青霉DSM62840和基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010干涉菌株的斜面培養物制取孢子懸浮液，調整孢子懸浮液的濃度為1.5×107spores/mL。取1 mL孢子懸浮液接種于100 mL MYB培養基中，24 ℃、150 r/min振蕩培養48 h。之后加入840 mg/L檸檬烯（0.22 μm過濾除菌）進行微生物轉化實驗[16]。轉化12 h之后，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用測定產物α-松油醇的含量[17]。實驗重復3 次。以野生型菌株的轉化產物α-松油醇含量為100%計。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的生物信息學分析

根據指狀青霉DSM62840基因組測序所得到的基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010氨基酸序列，對其理化性質及蛋白結構進行分析。結果顯示，PDIDSM_85260編碼732 個氨基酸，分子質量約為80 kDa，pI約為6.56。對其二級結構進行預測，結果顯示含有40.44%的α-螺旋、4.92%的延伸鏈、1.91%的β-轉角、52.73%的無規卷曲。圖1A是PDIDSM_85260編碼氨基酸的三維結構預測圖，可以看出該蛋白含有大量的α-螺旋和無規卷曲。

PDIDSM_08010編碼512 個氨基酸，分子質量約為54 kDa，pI約為8.10。其二級結構預測結果顯示含有33.98%的α-螺旋、21.68%的延伸鏈、9.77%的β-轉角、34.57%的無規卷曲。PDIDSM_08010編碼氨基酸的三維結構預測圖顯示該蛋白含有大量的α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈結構，含有較少的β-轉角（圖1B）。

圖1 PDIDSM_85260（A）和PDIDSM_08010（B）編碼蛋白的三維結構預測Fig. 1 Three-dimensional structure prediction of PDIDSM_85260 (A) and PDIDSM_08010 (B)

2.2 沉默載體的構建

2.2.1 目的基因RNAi序列和TEF1啟動子的擴增

使用TEF1F/R為引物，以模板pFC332為模版，進行PCR擴增獲得pFC332上的TEF1啟動子。使用85260F/R和08010F/R為引物，以指狀青霉DSM62840基因組DNA為模版，進行PCR擴增獲得基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列。其中TEF1啟動子大小為890 bp，PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列的大小分別為283 bp和306 bp。PCR擴增結果見圖2。擴增得到的條帶均為單一條帶，TEF1啟動子的條帶在750～1 000 bp之間，PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列的條帶在250～500 bp之間，靠近250 bp，與預期結果符合。

2.2.2 pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD質粒雙酶切

以EcoRI和BstEII對質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD進行雙酶切處理，37 ℃完全酶切3 h之后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，結果如圖3所示。質粒酶切之后條帶清晰，說明酶切徹底，并且大小符合預期結果。

圖3 pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of enzyme-digested products of pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD

2.2.3 沉默載體的構建

將pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD酶切骨架、TEF1啟動子以及PDIDSM_85620/08010的RNAi片段進行重組反應，并轉化至Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞中構建沉默載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1（圖4）。然后挑選陽性轉化子進行菌落PCR驗證。

以85260 F/08010 F、TEF1F為引物進行菌落PCR驗證，實驗結果如圖5所示。PCR擴增所得到的條帶均為單一條帶，大小約為1 200 bp，與預期符合。說明雙啟動子沉默載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1構建成功。挑選多個陽性克隆測序，對比測序結果，挑選不存在堿基突變和缺失的陽性克隆用于后續研究。

圖4 pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1（A）和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1（B）載體構建圖Fig. 4 Construction of vectors pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1 (A) and pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1 (B)

圖5 菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of colony PCR products

2.3 沉默菌株的篩選與鑒定

選取在含Hyg平板上可以穩定生長的轉化子，并以野生型菌株指狀青霉DSM62840作為對照，進行基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的real-time PCR驗證。如圖6所示，對于基因PDIDSM_85260，與野生型菌株相比，篩選得到的轉化子的表達量均有一定程度的下調，其中轉化子85260i-4、85260i-8、85260i-10的表達量分別下調了42.2%、42.1%、48%，因此，選擇這3 個轉化子進行進一步研究。

對于基因PDIDSM_08010，與野生型菌株相比，篩選得到的轉化子的表達量均有一定程度的下調，其中轉化子08010i-1、08010i-9、08010i-10、08010i-14的表達量分別下調了41.4%、58.3%、51%、49.7%，因此，選擇這4 個轉化子進行進一步研究。

圖6 干涉轉化子中基因相對表達量的分析Fig. 6 Relative expression levels of genes in RNAi transformants

2.4 干涉菌株的微生物轉化實驗

為進一步研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的功能，以野生型菌株為對照，進行干涉菌株的微生物轉化實驗，結果如圖7所示。對于基因PDIDSM_85260，實驗結果表明，與野生型菌株相比，轉化子85260i-4、85260i-8、85260i-10經過微生物轉化得到的α-松油醇含量均有不同程度的下降，分別下降了17.44%、16.35%、47.27%，說明基因PDIDSM_85260可能參與調控檸檬烯的微生物轉化過程。

對于基因PDIDSM_08010，與野生型菌株相比，轉化子08010i-1、08010i-9、08010i-10、08010i-14通過微生物轉化產生的α-松油醇的含量減少，尤其是08010i-9，含量下降了22.52%，說明基因PDIDSM_08010也可能參與調控檸檬烯的生物轉化過程。

3 討 論

目前，對于基因功能的研究主要有兩種方法，即增強基因的表達量和減弱或終止基因的表達。其中RNAi是最常用的降低基因表達量的技術。RNAi技術可以作為組學測序等技術篩選功能基因的工具，為真菌基因功能的研究提供新的見解[18-19]。對于絲狀真菌，使其自身產生dsRNA從而導致基因沉默的策略主要有兩種：發夾結構RNA（hairpin RNA，hpRNA）表達系統和雙向啟動子系統[20]。目前，已經有大量的研究使用RNAi技術誘導基因沉默，從而研究基因的功能[21-22]。Isabelle等[23]利用hpRNA表達系統對煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中的ALB1和FKS1基因進行了沉默，與野生型菌株相比，ALB1和FKS1基因的表達量下降了4倍。Wang Lei等[24]也利用hpRNA表達系統對里氏木霉（Trichoderma reesei）中的pyr4基因進行了沉默。Nguyen等[25]利用gpd和TrpC啟動子在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中構建雙啟動子系統，在這個系統中有37 個基因是被靶向，從而引起不同程度的沉默。并且在該系統中引入了綠色熒光蛋白eGFP，可以通過熒光信號檢測菌株的沉默效率。本研究使用雙啟動子系統構建沉默載體，以指狀青霉DSM62840的基因組為模板擴增目的基因的RNAi序列，以質粒pFC332為模板擴增TEF1啟動子，然后對載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP進行酶切處理，在gpdA啟動子后連接RNAi序列片段和TEF1啟動子片段，構建雙啟動子沉默載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1，用以研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010在檸檬烯轉化過程中的作用。

微生物細胞中的物質轉化過程錯綜復雜，在轉化過程中可能會受各種外界因素的影響。當微生物受到外界環境的刺激時，可以通過基因調控表達相關基因改變自身的生長和代謝方式，從而減少外界因素對自身的不利影響[26]。在這個基因調控的過程中，轉錄因子發揮著不可或缺的作用。在真菌中最常見的轉錄因子是Zn2Cys6類鋅指蛋白，鋅指蛋白是一個龐大的轉錄因子家族，該家族含有手指狀結構域，主要功能是調控基因的表達。研究表明Zn2Cys6類鋅指蛋白能夠參與調控真菌的基礎代謝、次級代謝以及藥物抗性等過程，在真菌的生長和代謝過程中發揮著重要的調控作用[27-28]。在本研究中，PDIDSM_85260作為一個轉錄因子，其干涉菌株轉化檸檬烯得到α-松油醇的含量，與野生型菌株相比有明顯下降，說明該基因可能參與調控檸檬烯的生物轉化過程。轉錄因子PDIDSM_85260可能通過結合檸檬烯轉化生成α-松油醇過程中的重要基因的啟動子區域調控這些基因的表達，從而直接或間接影響檸檬烯的微生物轉化過程。未來需要對PDIDSM_85260的靶標基因、其他潛在的基因功能以及可能存在的調控通路進行進一步的探索。

PDIDSM_08010，即DLD是一種NAD＋依賴的氧化還原酶，參與三羧酸循環。在受到外界因素的刺激下，DLD能夠影響活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成和清除以及三羧酸循環[29]。Jaewang等[30]研究發現DLD能夠誘導ROS、脂質過氧化和亞鐵的積累。研究指出DLD能夠通過調節細胞內ATP的生成、第二信使分子cAMP的生成以及ROS的生成和清除調控細胞內類固醇激素的合成[31]。研究發現與野生型菌株相比，PDIDSM_08010的干涉菌株轉化檸檬烯得到α-松油醇的含量顯著下降，這說明該基因可能參與調控檸檬烯的生物轉化過程。推測DLD可能通過調控細胞內的ATP含量、ROS等調節檸檬烯的微生物轉化過程。

4 結 論

利用RNAi技術構建了PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的干涉載體pCAMBIA1303-TrpC-HygrogpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1，經農桿菌介導轉化到指狀青霉DSM62840中。通過Hyg抗性篩選得到陽性轉化子，real-time PCR結果顯示與野生型菌株相比，基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010干涉轉化子的表達量均有所下降，說明干涉菌株構建成功。此外，干涉菌株的微生物轉化實驗結果表明，與野生型菌株相比，干涉菌株轉化檸檬烯得到α-松油醇含量均有不同程度的下降，說明基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010可能參與調控檸檬烯生物轉化生成α-松油醇的過程。