植物乳桿菌對干腌馬鮫魚降鹽增鮮效果的影響

梁進欣，陳曉紅，李 珊，楊 娟,2，趙文紅，白衛東,2,*

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農業工程學院現代農業工程創新研究院，廣東 廣州 510225）

馬鮫魚是我國重要的經濟魚類，其肉質鮮美，且含有大量的蛋白質、多肽、氨基酸以及礦物質等營養物質，深受消費者喜愛。馬鮫魚不僅可以鮮食，還可以作為干腌制品，干腌馬鮫魚在我國的銷量與消費潛力巨大。目前市面上的干腌馬鮫魚制作過程中通常加入大量食鹽，以此降低產品水分含量與水分活度，抑制微生物的生長繁殖，從而達到延長馬鮫魚貨架期的目的[1]。但高食鹽的制作方式不僅會影響產品質量，而且對人體健康有一定的傷害，會引發高血壓、心血管等慢性疾病[2]。因此，近年來在魚的腌制過程中大多使用鉀鹽、鈣鹽等，以代替部分食鹽[3-4]，但鉀鹽、鈣鹽等食鹽替代物會使干腌魚制品產生不良的滋味特性，如金屬味與苦澀味[5]。

目前許多研究表明乳酸菌在食品生產中應用廣泛，不僅能夠抑制有害微生物的生長繁殖，還能夠產蛋白酶，降解蛋白質，促進滋味物質的產生，如小分子肽、游離氨基酸等滋味物質[6]。滋味物質通常賦予食物鮮味、厚味等味感[7]，同時也具有咸味和增咸作用[8]，因此在魚的腌制過程中，接種乳酸菌能起到降鹽增鮮的效果，如游剛[9]發現乳酸菌不僅可改善干腌魚的風味還能在腌制過程中減少食鹽的用量；吳燕燕等[10]在魚腌制后接種乳酸菌且降低用鹽量，發現其鮮味氨基酸占比大于高鹽組，說明乳酸菌促進了滋味物質的產生，同時也增強了產品的滋味特性；閆博文等[11]通過電子舌測定發現添加植物乳桿菌制作酸面團，其咸味強度高于空白組，認為其咸味與植物乳桿菌代謝形成的小分子肽有關。因此本研究以馬鮫魚為原料，腌制后接種植物乳桿菌制作干腌馬鮫魚，以經過4%（m/m）食鹽與2%（m/m）食鹽腌制處理的干腌馬鮫魚分別作為對照組1與對照組2，研究植物乳桿菌對干腌馬鮫魚的降鹽增鮮作用，旨在為探究植物乳桿菌應用于馬鮫魚加工生產與產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鮫魚購于海南省海口市覺森商店；植物乳桿菌24258（Lactobacillus plantarum）購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

5’-腺苷酸（adenosine 5’-monophosphate，5’-AMP）、5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate，5’-IMP）、5’-鳥苷酸（guamosine 5’-monophosphate，5’-GMP）、肌苷（inosine，HxR）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx） 上海源葉生物試劑有限公司；氨基酸標準品及衍生試劑 安捷倫科技有限公司；細胞色素C（12 384 Da）、抑酞酶（6 511 Da）、氧化型谷胱甘肽（621 Da）和Gly-Gly-Gly（189 Da） 美國Sigma公司；其他試劑購自廣州東巨生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SP-02型生化培養箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海培因實驗儀器有限公司；CR-400色差儀 深圳市天友利標準光源有限公司；水分活度儀 深圳冠亞水分儀科技有限公司；FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；5810型高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌馬鮫魚加工與取樣

加菌組：按2%（m/m）加入食鹽，均勻涂抹于魚塊表面，5 ℃靜腌5 h，接種植物乳桿菌，菌液濃度108CFU/mL，接種量為10 mL/100 g，25 ℃靜置發酵2 h，然后魚塊置于15 ℃生化培養箱干燥，干燥至魚塊水分質量分數為30%～35%，包裝為成品。

對照組1：按4%（m/m）加入食鹽，均勻涂抹于魚塊表面，5 ℃靜腌5 h，腌制后的魚塊加無菌水，加水量為10 mL/100 g，置于25 ℃生化培養箱2 h，后魚塊置于15 ℃生化培養箱干燥，干燥至魚塊水分質量分數為30%～35%，包裝為成品。

對照組2：按2%（m/m）加入食鹽，其余同對照組1。

加工過程分5 個階段取樣：生肉、腌制期、干燥1 d、干燥3 d、干燥5 d，每個階段取樣后均用絞肉機絞碎，且置于－40 ℃冰箱保存。

1.3.2 基本理化指標的測定

水分含量的測定：參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法；水分活度的測定：參考GB 5009.238—2016《食品水分活度的測定》水分活度儀擴散法；pH值的測定：參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》；食鹽含量測定：參考GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》銀量法；色度：用色度儀測定。

1.3.3 干腌馬鮫魚的感官評定

對13 名參與人員進行甜、苦、咸、鮮、厚味等味道的鑒別實驗，組成感官評價小組，分別對兩組干腌馬鮫魚的滋味進行評價（甜味、苦味、咸味、鮮味、厚味）。采用10 分制進行打分，然后取結果的平均值。每個評定員，獨立評分，每品嘗完一個樣品，用蒸餾水漱口，再進行下一個樣品的品嘗。

1.3.4 核苷酸及其降解產物的測定

樣品制備參照Ryder[12]的方法，準確稱取5.00 g樣品，加入15 mL 5%高氯酸溶液，重復均質3 次，10 000 r/min離心15 min，上清液過濾，用去離子水定容到25 mL，用1 mol/L KOH溶液調pH值至6.5，過0.22 μm水系濾膜，待測。色譜柱采用ZIC?-HILIC（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 5.3），流動相B為純乙腈；洗脫程序為V（A）∶V（B）=20∶80；等度洗脫；流速1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm。

1.3.5 游離氨基酸的測定

樣品前處理參考Aro等[13]的方法略作修改：準確稱取5.00 g樣品，添加4%的三氯乙酸25 mL，重復均質3 次，10 000 r/min離心20 min，上清液過濾，用去離子水定容到50 mL，37 ℃水浴1 h后，用0.22 μm水系濾膜過濾。采用Agilent自動衍生進樣程序，用高效液相色譜儀分析。

1.3.6 肽分子質量分布的測定

參考莫加利等[14]的方法略作修改：準確稱取5.00 g碎肉，加入20 mL去離子水，重復勻質3 次，沸水浴提取120 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm水系濾膜，待測。色譜柱采用TSKGel-G2000-SWXL（7.8 mm×300 mm），流動相為0.1 mol/L磷酸鹽溶液（pH 6.7），流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，紫外檢測波長214 nm。標準樣品的相對分子質量對數值與洗脫體積擬合直線方程為y=－0.887 5x＋27.793（R2=0.976 8），其中y為標準肽相對分子質量的對數；x為保留時間/min。

1.3.7 滋味強度值（taste activity value，TAV）分析

TAV為樣品中某呈味物質濃度與其味道閾值之比，若TAV大于1，則可以認為該物質對樣品的滋味有重要貢獻，若TAV小于1，則可以認為該物質對樣品滋味貢獻不明顯[15]。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 22.0對數據進行方差分析及相關性分析，P＜0.05，差異顯著；采用Origin 2018進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 干腌馬鮫魚加工過程中基本理化指標分析

從表1可知，在干腌過程中，干腌馬鮫魚的水分活度與水分含量呈顯著的下降趨勢。到干燥第5天，加菌組、對照組1、對照組2的水分活度和水分質量分數分別為0.83、0.86、0.86和33.92%、34.27%、34.86%，均達到保藏要求，且加菌組的水分活度顯著低于對照組1、對照組2（P＜0.05），其原因可能是植物乳桿菌的活動加速產品的水分活度的降低及水分的流失[16]。在干腌過程中，微生物快速繁殖，分解魚肉中的蛋白質、碳水化合物等，產生乳酸、乙酸等酸性代謝產物，pH值會逐漸降低。加菌組在干燥5 d pH值顯著降低，達到5.85，由于植物乳桿菌能夠大量產生乳酸等有機酸，而且作為優勢菌，還能抑制腐敗菌的生長繁殖[17]。在干腌過程中，由于水分不斷散失與食鹽的滲透作用，氯化物質量分數不斷上升，從生肉0.09%上升到產品的5.02%（對照組1）、2.66%（對照組2）和2.58%（加菌組），樣品含鹽量均顯著增加，但是由于加菌組與對照組2的食鹽添加量均為對照組1的一半，因此最終產物中鹽含量也低于對照組1。

2.2 干腌馬鮫魚加工過程中色差變化

從表2可看出，加菌組與對照組1、對照組2的亮度（L）、紅度（a*）、黃度（b*）在加工過程有顯著變化（P＜0.05），在腌制發酵過程中，魚肉收縮，肌纖維間距減小，導致亮度變暗，而在干燥過程中，由于血紅蛋白氧化，以及微量的美拉德反應等使魚肉的色澤降低，從而魚肉的亮度隨著降低，紅度上升[18]；而在腌制過程中，紅度變為負值，可能是由于魚肉表面的少量的肌紅蛋白與食鹽反應產生膽綠素[19]。魚肉在干燥環境下，黃度升高，說明魚肉脂肪氧化，在黃度上，加菌組與對照組1、對照組2沒有明顯差異。在干燥第5天加菌組樣品的亮度、紅度、黃度與對照組1、對照組2沒有明顯的差異（P＞0.05），說明植物乳桿菌的添加對干腌馬鮫魚的外觀品質無顯著影響。

表1 干腌馬鮫魚加工過程中水分含量、水分活度、pH值、鹽含量的變化Table 1 Changes in water content, water activity, pH and salt content of dry-cured mackerel at different processing stages

表2 干腌馬鮫魚加工過程中色差變化Table 2 Changes in color parameters of dry-cured mackerel at different processing stages

2.3 干腌馬鮫魚的味覺特性分析

為確定干腌馬鮫魚基本味感特性，將3 組干腌馬鮫魚隔水蒸煮，并且進行感官評價。如圖1所示，咸、鮮、厚味是干腌馬鮫魚主要的味覺特性，加菌組與對照組1、對照組2的味覺特性有明顯差異。加菌組與對照組2的干腌馬鮫魚只添加了2%食鹽，其氯化物質量分數分別為2.66%與2.58%，但加菌組的咸味、鮮味、厚味均高于對照組1與對照組2，說明植物乳桿菌有較好的增咸、增鮮效果。植物乳桿菌能夠產生蛋白酶，促進蛋白質分解成小肽與氨基酸。小肽與氨基酸是干腌馬鮫魚主要的呈味物質[20-21]，因此可以推測，植物乳桿菌的添加有利于干腌馬鮫魚中呈味物質的產生，尤其是咸味、鮮味和厚味物質。

圖1 干腌馬鮫魚感官評定雷達圖Fig. 1 Radar chart for sensory evaluation of dry-cured mackerel

表3 干腌馬鮫魚加工過程中游離氨基酸含量的變化Table 3 Changes in free amino acid contents in dry-cured mackerel at different processing stages mg/100

2.4 干腌馬鮫魚加工過程中游離氨基酸含量的變化與TAV分析

游離氨基酸是干腌魚中典型的滋味物質，其種類及含量能夠改善干腌魚的口感，提高味感。從表3可知，樣品經過干腌后，其游離氨基酸含量均顯著增加，而加菌組增幅顯著高于對照組1、對照組2（P＜0.05），到干燥5 d其總游離氨基酸是對照組1與對照組2的1.3、1.5 倍。其中，鮮味氨基酸與甜味氨基酸的含量與占比均高于對照組1，而苦味氨基酸的占比則低于對照組1與對照組2，說明植物乳桿菌的添加，有利于產品鮮、甜味氨基酸的產生，降低苦味氨基酸的占比，提高了產品的整體滋味。

圖2 干腌馬鮫魚游離氨基酸的TAVFig. 2 TAV of free amino acids in dry-cured mackerel

從圖2可知，甜味氨基酸中，只有甲硫氨酸的TAV大于1，其余的甜味氨基酸的TAV均小于1，高濃度的咸味會抑制甜味，而且鮮味物質對甜味有一定的抑制作用[22]，Kemp等[23]發現高濃度的谷氨酸鈉能夠抑制甜味的呈現，因此在干腌馬鮫魚的感官評定中，甜味不是主要的味感。對照組1與對照組2中鮮味氨基酸的TAV均小于1，對鮮味的貢獻不大，而加菌組中雖然天冬氨酸的TAV低于1，但谷氨酸的TAV接近1.5，對干腌馬鮫魚的鮮味貢獻極大，更好地促進加菌組干腌馬鮫魚的鮮味味感的呈現。許多研究表明谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸能夠增強咸味味感，屬于咸味或增咸氨基酸[24-26]，因為谷氨酸與天冬氨酸能夠與氯化鈉產生協同增效作用，不僅能增強鮮味強度[27]，還能增強咸味強度，Rocha等[28]發現谷氨酸能夠在低濃度的氯化鈉溶液中表現出增強咸味的能力，而且比GMP、IMP的增咸能力更強；Jinap等[25]發現在辣湯中加入0.7%味精可以降低32.5%的鈉添加量；而精氨酸、賴氨酸盡管是苦味氨基酸，但也具有增強風味的能力，在一定程度上能夠提高產品的咸味強度[26]，Toelstede等[26]在奶酪蛋白的感官重組實驗中發現缺乏精氨酸的實驗組其咸味強度降低了0.6 個單位；而且苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸在低于其閾值時也能增加干腌馬鮫魚的呈味復雜性，并適當提高咸味與鮮味強度[29-30]。因此通過干腌馬鮫魚的游離氨基酸含量及其TAV分析，加菌組樣品的鮮味氨基酸、咸味及增咸氨基酸的TAV均高于對照組1與對照組2（P＜0.05），因此其咸味與鮮味強度與圖1干腌馬鮫魚味感特性評價相符。

2.5 干腌馬鮫魚肽分子質量分布分析

從圖3可知，對照組1中＜5 kDa的小分子肽段高于對照組2，說明4%食鹽腌制比2%食鹽腌制更好地增強魚內組織蛋白酶的活性，促進魚肉蛋白的分解，該結果與表3總游離氨基酸含量結果相符，其原因可能是由于在一定范圍內適度的高鹽腌制可增強組織蛋白酶活性[31]。加菌組樣品中呈味小分子肽段（＜5 kDa）[32-33]占比顯著高于對照組1、對照組2（P＜0.05），其中加菌組＜1 kDa的肽段占比為21%，是對照組1、對照組2的1.5、3 倍，此肽段區間是鮮、厚味富集區域[34]，說明植物乳桿菌的添加有利于鮮、厚味肽的產生，而大部分的鮮、厚味肽具有一定的增鮮、增咸的作用[33]，可以提高產品的整體風味，而這些肽段里是否含有咸味肽則需要進一步的研究。因此可推測加菌組樣品中含有較多的鮮味肽、厚味肽，進一步證明其鮮味、咸味、厚味強度與圖1吻合。

圖3 干腌馬鮫魚的肽分子質量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of peptides in dry-cured mackerel

2.6 干腌馬鮫魚加工過程中的核苷酸含量的變化

核苷酸中AMP、IMP、GMP是典型的鮮味劑，在食物中廣泛存在，核苷酸的代謝途徑為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx）[35-36]。從表4可知，在生肉中檢測鮮味物質AMP、IMP分別是10.51、247.37 mg/100 g，GMP未檢出。而在腌制時期，加菌組與對照組1、對照組2均檢出AMP、IMP，但加菌組的IMP含量顯著低于對照組1與對照組2，可能是植物乳桿菌加快了IMP的代謝；到干燥5 d，加菌組與對照組1、對照組2都未檢出鮮味核苷酸，而Hx在干腌過程中的含量不斷升高，可能由于內源酶與微生物酶的作用，核苷酸已全部降解為HxR和Hx。加菌組樣品中的苦味核苷酸含量（Hx、HxR）顯著高于對照組1、對照組2，及其部分苦味氨基酸的TAV大于1，特別是組氨酸，其TAV高達3.3，對苦味強度有一定的提高，而對照組1樣品中食鹽含量較高，可能在一定程度上掩蓋苦味，與圖1感官評價結果吻合。

表4 干腌馬鮫魚加工過程中核苷酸含量的變化Table 4 Changes in nucleotide contents in dry-cured mackerel at different processing stages mg/100 g

3 結 論

通過對干腌馬鮫魚的基本理化指標與色度測定，得出加菌組的水分活度與pH值顯著低于對照組1、對照組2（P＜0.05），腌制后接種植物乳桿菌有利于干腌馬鮫魚的保藏，對色澤的影響不顯著，不影響干腌馬鮫魚的外觀品質。經過感官評價與呈味物質的比較分析，加菌組樣品鮮味、咸味、厚味都優于對照組1、對照組2，特別在咸味特性中，加菌組只添加2%食鹽，咸味強度卻高于對照組1，證明植物乳桿菌在一定程度上能促進干腌馬鮫魚中鮮味、厚味及增咸物質的產生。加菌組的鮮味氨基酸TAV和＜1 kDa肽占比顯著高于對照組1與對照組2（P＜0.05），由于鮮味氨基酸與＜1 kDa的肽段本身具有鮮味、厚味等味感，而且也具有一定的增咸作用，因此加菌組樣品的鮮味、咸味、厚味強度與感官評定的結果相符，證明植物乳桿菌的添加可以降低干腌制品中食鹽的添加，同時還可以增加干腌制品的鮮味、咸味及厚味等味感，有較好的降鹽增鮮效果。本研究探討植物乳桿菌對干腌馬鮫魚的降鹽增鮮效果，為植物乳桿菌應用于干腌制品的工藝改良、產品開發與滋味研究提供一定的理論支撐。