基于HS-SPME-GC-MS非靶向分析不同發酵小米辣的風味差異

葉 子，商智勛，李美奇，任洪冰，屈用函，胡小松,4，易俊潔,*

（1.昆明理工大學食品科學與工程學院，云南 昆明 650500；2.云南宏斌綠色食品集團有限公司，云南 玉溪 652600；3.云南省文山州農業科學院辣椒作物研究所，云南 文山 663000；4.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

辣椒（Capsicumspp.）是一種全球種植和消費的蔬菜作物，中國是辣椒最大的生產國，辣椒產量占世界辣椒產量的1/3[1]。據聯合國糧食及農業組織統計，2017年全球辣椒產量約為3 600萬 t，其中中國產量為1 780萬 t[1]。在眾多辣椒品種中，小米辣（Capsicum frutescensL.）是我國唯一的野生辣椒品種資源，果實呈短圓錐形、短指形或米粒形，青熟果果皮淡黃色、綠色或黑色，辣味濃郁，味道香濃、營養豐富[2-3]。云南作為全國小米辣遺傳多樣性和生態多樣性的中心，目前共收集到不同品種小米辣種質資源59 份[4-5]。小米辣作為加工型辣椒品種，是發酵辣椒的重要原料，發酵后的小米辣因其獨特的口感和風味深受消費者青睞，可作為開胃菜和調味品，同時也是滇菜核心風味的重要來源之一[6-8]。

在影響辣椒及其制品品質的眾多因素中，獨特的香氣直接決定其商業價值，是影響消費者購買行為的重要評判指標[9]。根據以往的研究，不同品種的果蔬在風味以及加工特性上存在較大差異[10-11]。目前，已有不少關于辣椒風味的報道。Morales-Soriano[12]和Pino[13]等分析了不同品種新鮮辣椒的香氣輪廓，發現品種間的揮發性香氣成分差異較大，品種是影響辣椒風味的重要因素。此外Xu Xinxing[14]、尹小慶[15]和王雪梅[16]等還分別對泡椒、鲊辣椒和郫縣豆瓣等發酵辣椒制品的風味物質進行了差異性分析。然而，目前對新鮮和發酵小米辣產品揮發性香氣成分的對比研究較少，不同品種發酵小米辣的香氣輪廓和特征性風味物質的研究鮮見報道。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術因其方便快捷、靈敏度高、選擇性與重復性好，能較真實地反映食品中揮發性物質的基本組成，目前廣泛應用于發酵食品揮發性香氣成分的分析[14]。針對以上問題，本研究以云南具有代表性的不同小米辣品種為研究對象，采用HS-SPME-GC-MS聯用技術對發酵前后小米辣產品的揮發性香氣成分進行測定，并通過偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法結合變量鑒定系數（variable identification，VID）分析不同小米辣發酵前后揮發性香氣成分的差異性。同時，通過對不同小米辣原料發酵適宜性的分析，以期為不同品種小米辣的選育及后期不同專用型發酵小米辣產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 個不同品種的新鮮小米辣（圖1），均由云南省文山州農業科學院辣椒研究所提供，具體樣品信息如表1所示，其中新鮮小米辣以X表示，發酵小米辣（泡椒）以P表示。采摘后的新鮮小米辣在企業進行3 個月的自然發酵，并對其發酵前后揮發性香氣成分進行測定。所有樣品均密封包裝并于4 ℃保存。

氯化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；正構烷烴混標（C3～C25） 美國o2si公司；己酸葉醇酯等17 種色譜標準品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

圖1 不同品種的新鮮小米辣（A）和發酵小米辣（B）Fig. 1 Fresh (A) and fermented (B) C. frutescens from different cultivars

表1 樣品采集基本信息Table 1 Information about C. frutescens samples collected in this study

1.2 儀器與設備

Vortex 2渦旋儀 德國IKA公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取探針 美國Supelco公司；HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；QP 2010氣相色譜-質譜聯用儀 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發性香氣成分的提取

采用頂空固相微萃取法提取小米辣中的揮發性香氣成分[9]。樣品勻漿后稱取3 g樣品勻漿于10 mL頂空瓶中，加入3 mL飽和NaCl溶液，立即密封，渦旋1 min后置于磁力攪拌器中，于40 ℃，500 r/min下平衡15 min。將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取探針插入樣品瓶頂空部分，于40 ℃，500 r/min吸附40 min，然后將萃取探針插入GC進樣口，于250 ℃解吸5 min。每個樣品均進行6 次平行實驗。

1.3.2 揮發性香氣成分的檢測

儀器參數[9]：HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；初始溫度45 ℃保持1 min，再以5 ℃/min升到250 ℃，保持2 min。進樣口溫度250 ℃，載氣（He）流速2.0 mL/min，不分流進樣。電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸管線溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z35～500。每個樣品均進行6 次平行實驗。

1.3.3 揮發性香氣成分的定性定量分析

總離子流色譜圖積分后與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）2014 Library數據庫進行對比，選取匹配度大于80%的物質，再根據相同色譜條件下正構烷烴混標（C3～C25）保留時間計算檢測物質的保留指數（retention index，RI）以進一步確定各香氣成分。每個樣品中加入60 μL 3-辛醇（4.15×10－2μg/L）為內標物計算出各揮發性香氣成分的相對含量。對正己醛、羅勒烯、己酸異戊酯、己酸己酯、己酸葉醇酯、4-甲基戊醇、(E)-2-壬醛、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、丁酸丁酯、水楊酸乙酯、β-月桂烯、D-檸檬烯、羅勒烯、乙酸己酯、2-壬醇、2-乙基丁醛、異丁酸己酯采用外標法定量分析。

1.4 數據處理

所有實驗所得數據均用Origin 2020進行數據處理。采用Solo 6.5（Eigenvector Research, USA）軟件進行多元數據分析，步驟如下：1）進行自動定量預處理，包括均值中心化和方差縮放；2）對多變量數據進行主成分分析以檢測可能的異常值和分組；3）用PLS-DA回歸分析揮發性香氣成分與辣椒品種之間的關系。將檢測到的揮發性香氣成分和辣椒品種分別作為X和Y變量。模型采用百葉窗交叉驗證，根據交叉驗證的均方根誤差值和交叉驗證相關系數選擇潛在變量數（latent variable，LV）；4）計算變量鑒別系數VID，將揮發性香氣成分與辣椒品種的相關性進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 揮發性香氣成分分析

圖2 不同品種新鮮和發酵小米辣揮發性香氣成分的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of aroma components in fresh and fermented C. frutescens from different cultivars

如圖2所示，不同品小米辣揮發性香氣成分差異明顯，揮發性香氣成分的種類和含量均明顯增加。在這些揮發性香氣物質中，新鮮小米辣的共有香氣成分有13 種，其中除烷烴外，還有羅勒烯、己醛、(E)-2-己醛、正己醇、芳樟醇、水楊酸甲酯和3-甲基丁酸-4-甲基戊酯等，這些物質具有清新味、薄荷味和果香味等特征[9,12]。發酵后每個品種中揮發性香氣成分的種類和含量均明顯增加，(E)-2-庚醛、(E)-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮、(E)-芳樟醇氧化物、水楊酸乙酯和α-松油醇等為發酵后新產生的共有揮發性特征香氣成分。根據之前研究，(E)-2-庚醛、羅勒烯和芳樟醇為發酵小米辣主要揮發性香氣成分，分別賦予其獨特的蔬菜味、甜味和果香味[9]。

酯類是小米辣的主要揮發性香氣成分，含量在新鮮小米辣中約為15.40%（X1）～91.79%（X6），在發酵小米辣中為18.26%（P1）～74.40%（P6）。酯類大多具有令人愉悅的花香和水果香，有助于辣椒的整體風味提升[8]。2-甲基丁酸-4-甲基戊酯和3-甲基丁酸-4-甲基戊酯是小米辣中含量最高的酯類，賦予辣椒果香味[9,12]。其次是水楊酸甲酯，其在提供薄荷香氣的同時，還可增加辣椒的抗氧化能力和降低腐爛率，延長貨架壽命[17]。除此之外，還檢測到乙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和十一烷酸的烷基酯，它們大多以脂肪酸為前體物質，經脂肪酸的氧化代謝而形成。支鏈酸酯（以2-甲基丁酸-4-甲基戊酯和3-甲基丁酸-4-甲基戊酯為主）是辣椒中的主要酯類物質，主要來源于氨基酸的代謝[8,13]。

萜烯類物質是小米辣中第2大類香氣物質，分別占新鮮和發酵小米辣含量的0.61%（X7）～23.28%（X9）和3.20%（P7）～49.09%（P1）。萜烯類物質閾值較低，具有花香和果香，對總體風味的貢獻較大[18]。萜烯苷類可以水解釋放出萜烯苷元，例如芳樟醇、香葉醇和橙花醇，增強了辣椒的香氣。發酵后萜烯的含量和種類顯著增加，這可能是因為結合的萜烯糖苷被水解生成揮發性香氣化合物或在發酵過程中轉化為其他化合物[19]。另外，在新鮮和發酵小米辣中均發現了D-檸檬烯、羅勒烯、β-長葉蒎烯和(E)-β-紫羅酮。羅勒烯、γ-雪松烯、D-檸檬烯和芳樟醇為新鮮小米辣的主要萜烯類物質，經過發酵加工后，形成了以α-松油醇為代表的11 種新生成的萜烯類物質，其次是(E)-氧化芳樟醇和β-月桂烯。

除酯類和萜烯類物質之外，新鮮和發酵小米辣中的揮發性香氣成分還有醇類、醛類、酮類和酸類等物質，但相對含量較低。在這些物質里，所有樣品中均檢出己醇，且發酵后含量有所增加。另外，在醛類物質中，(E)-2-己醛和己醛是新鮮小米辣的主要醛類物質，但在發酵小米辣中未見檢出。在發酵小米辣里，(E)-2-庚醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛和(E)-2-辛烯醛為主要醛類物質。此外，在辣椒1和辣椒9中都檢測到了低含量的2-甲氧基-3-異丁基吡嗪，但因其較低的感知閾值，可以極大地促進辣椒的風味[23]。

2.2 主體風味物質的分析

風味物質對樣品風味的貢獻需進一步結合風味物質的閾值進行評價，化合物的閾值不同，風味物質對整體風味貢獻也不一樣。為了評價香氣化合物對小米辣香氣的影響，本研究測定小米辣中不同揮發性香氣成分的氣味活度值（odour active value，OAV），用以評價其對風味的貢獻[18]。并且認定OAV大于1的香氣成分為小米辣中的關鍵香氣成分，對小米辣的整體香氣起主導作用[20]。

在眾多的香氣組分中，OAV大于1的組分會對小米辣的香氣造成顯著影響。表2列出新鮮和發酵小米辣中OAV大于0.1的風味物質，新鮮小米辣整體呈現清新和辛辣的風味，其中主要的風味物質為1-辛烯-3-酮和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪。其中1-辛烯-3-酮是新鮮小米辣中最重要的香氣組分，OAV最高（OAV=69.56），賦予了新鮮小米辣蘑菇和蔬菜香氣。2-甲氧基-3-異丁基吡嗪是青辣椒的主要香氣成分，香氣濃郁，賦予辣椒特有的類似于青椒和咖啡的風味[8,21]。發酵小米辣中的主體風味物質共有5 種，分別為己酸葉醇酯、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪、(E)-2-壬烯醛、己酸異戊酯和己酸庚酯。發酵小米辣中的主體風味物質以酯類為主，與新鮮小米辣相比呈現更柔和、更濃郁的果香味。2-甲氧基-3-異丁基吡嗪為新鮮和發酵小米辣中唯一共有的關鍵香氣成分，之前的研究中也表明2-甲氧基-3-異丁基吡嗪是發酵辣椒醬中芳香活性最強的化合物之一[22]。

表2 小米辣特征組分風味描述及OAVTable 2 Sensory properties and OAV of characteristic components in fresh and fermented C. frutescens

2.3 發酵小米辣揮發性香氣成分差異分析

為全面分析不同品種發酵小米辣的香氣輪廓和特征性香氣成分，本研究基于非靶向HS-SPMEGC-MS聯用的大量數據，結合多元數據分析技術（PLS-DA模型），進行小米辣發酵前后揮發性香氣成分和不同小米辣揮發性香氣成分的差異分析。

2.3.1 發酵前后小米辣揮發性香氣成分差異分析

如圖3A所示，新鮮小米辣里共檢出56 種揮發性香氣成分，其中包括酯類25 種、萜烯類7 種、醇類5 種、醛類5 種、酮類1 種、酸類1 種、吡嗪類1 種和其他類11 種，而經過發酵加工后，小米辣有119 種揮發性香氣成分被檢出，其中包括酯類45 種、萜烯類26 種、醇類9 種、醛類7 種、酮類6 種、酸類5 種、吡嗪1 種和其他類20 種。由此可見，發酵小米辣揮發性香氣成分的種類均顯著增加，使發酵辣椒的風味更豐富，這與發酵過程中豐富的代謝產物與發酵微生物群落相互作用緊密相關[15]。

圖3 B以揮發性香氣成分作為X變量，發酵前后的小米辣作為Y變量構建基于PLS-DA模型的發酵前后小米辣揮發性香氣成分的Bi-plot。Bi-plot由得分圖和載荷圖兩部分組合而成，得分圖中顏色和形狀各異的符號，代表不同的辣椒品種。載荷圖中的空心圓圈代表揮發性香氣成分，根據VID值篩選出的特征性香氣成分以加粗的空心圓圈表示。如圖3B所示，主要的趨勢體現在LV1上（Y=80%），表明發酵前后小米辣的揮發性香氣成分差異顯著。為了進一步半定量分析發酵前后小米辣特征性揮發性香氣成分，本研究計算了VID系數，并以|VID|≥0.700為判定標準篩選特征性香氣指標[4]。

在得分圖中，樣品越接近，表明樣品的香氣越接近，反之樣品離的越遠，表明其香氣差異越顯著。從圖3B樣品分布可以看出，新鮮小米辣組和發酵小米辣組明顯分開，且新鮮小米辣聚集在一起，而發酵后的樣品有不同程度的分散，表明不同品種新鮮小米辣的揮發性香氣成分較為相似，發酵后揮發性香氣成分的差異均顯著增加。另外，從載荷圖可以觀察到更多的揮發性香氣成分分布在發酵小米辣周圍，也表明了發酵后小米辣揮發性香氣成分的種類明顯增加。

通過計算VID系數，一共篩選出了13 種特征性香氣物質，其中包括酮類2 種、醛類3 種、酯類4 種和萜烯4 種（圖3C）。圖3C顯示，新鮮小米辣的特征性香氣物質顯著少于發酵小米辣，僅有13-甲基十四醛和(Z)-3-己烯乙酸酯2 種。Morales-Soriano等[12]的研究也發現13-甲基十四醛和(Z)-3-己烯乙酸酯篩為秘魯新鮮辣椒的特征性香氣成分。發酵小米辣的特征性香氣成分有11 種，包括4 種萜烯類物質（α-松油醇、α-蒎烯、芳樟醇和(E)-氧化芳樟醇）、3 種酯類物質（8-甲基-6-烯酸-4-甲基戊酯、水楊酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯）、2 種醛類物質（(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚醛）和2 種酮類物質（6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-庚酮）。表明發酵形成了更多特征性的風味化合物，其中酯類和萜烯類物質仍為其最主要的特征性香氣物質，顯著增強了發酵小米辣的花香味和果香味。這些酯類物質的形成可能與酶（如醇脫氫酶）催化的有機酸和醇類物質的酯化反應有關[24]。醛類和酮類物質也是傳統發酵食品中重要的揮發性風味物質。醛類物質可以通過不飽和脂肪酸的氧化降解和氨基酸的Strecker降解產生，酮類物質也主要來源于不飽和脂肪酸和氨基酸的降解[25]。在發酵過程中，微生物轉氨酶可以將氨基酸轉化為α-酮酸，而α-酮酸又可以被各種脫羧酶降解為相應的醛和酮[26]。Kang等[22]也發現(E)-2-辛烯醛在發酵辣椒醬中的濃度較高，與本研究結果相似。

圖3 不同小米辣發酵前后揮發性香氣成分的差異性分析Fig. 3 Differences in volatile aroma components C. frutescens from different cultivars between before and after fermentation

2.3.2 不同小米辣揮發性香氣成分差異分析

為更好地分析不同品種辣椒的風味特性，通過PLS-DA模型對比新鮮和發酵小米辣的揮發性香氣成分（圖4）。構建的PLS-DA模型以揮發性香氣成分作為X變量，不同品種作為Y變量。以|VID|≥0.800為判定標準篩選特征性香氣指標[27]，圖4中篩選出的特征性香氣成分及其含量見表3。

從圖4A可以看出，不同品種小米辣的揮發性香氣成分種類和組成存在顯著性差異，在X1～X9中分別檢測到26、51、45、49、52、47、47、49 種和20 種揮發性香氣成分。可以看出X1與X9的揮發性香氣成分的種類和含量都明顯低于其他品種（圖2A和圖4A）。從圖4C可以看出，不同品種新鮮小米辣都兩兩分隔，表明不同品種新鮮小米辣間的香氣成分存在明顯差異。其中X1和X9、X2和X8在揮發性香氣成分的組成上較為相似。從載荷圖看，X7中揮發性香氣成分的種類明顯多于其他品種，風味更加豐富。VID值篩選結果顯示，X7中篩選出8 種特征性香氣成分，包括己酸乙酯等7 種酯類和4-甲基戊醇，表明這些香氣成分在X7中的含量較高，賦予了X7更濃郁的果香味。X1中篩選出6 種特征性香氣成分，其中除2-甲氧基-3-異丁基吡嗪在X1中的含量較高外，其余5 種香氣成分在X1中的含量均顯著低于其他品種。正己醛、羅勒烯和己酸異戊酯分別為X3、X4和X6中的特征性香氣成分，含量分別為131.47、126.90 μg/kg和46.20 μg/kg，分別代表清新味、草木味和果香味[28]。X9中(E)-2-壬醛和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的含量較其他品種高，分別為0.26 μg/kg和1.65 μg/kg，整體呈清新的黃瓜味和胡椒味。

表3 不同品種新鮮和發酵小米辣中篩選出的特征性揮發性香氣成分Table 3 Characteristic volatile aroma compounds identified in fresh and fermented C. frutescens from different cultivars

圖4 不同新鮮和發酵小米辣揮發性香氣成分的差異性分析Fig. 4 Differences in volatile aroma components in fresh and fermented C. frutescens among different cultivars

經過發酵后，不同品種小米辣（P1～P9）分別檢測到38、92、85、75、75、86、78、84 種和37 種揮發性香氣成分（圖4B），揮發性香氣成分的種類均明顯增加。如圖4D所示，與新鮮小米辣相比，不同品種發酵小米辣的揮發性香氣成分顯示出新的趨勢。發酵后的P1和P9依舊較為接近，另外P2、P7與其余品種發酵小米辣的揮發性香氣成分差異較大且P2和P7中揮發性香氣成分的種類較多。P7中一共篩選出13 種特征性揮發性香氣成分，包括10 種酯類（如2-甲基丁酸芐酯、3-甲基丁酸戊酯和3-甲基丁酸庚酯等）、1 種醇類（2-壬醇）、1 種醛類（2-乙基丁醛）和1 種酮類（3,5-二甲基-2-辛酮）。不同于新鮮X2（未篩選到特征性香氣成分），P2中一共篩選出了8 種特征性物質，包括具有果香味的酯類和萜烯類物質，這與之前的研究結果一致[8,12]。羅勒烯在X4和P4中含量始終最高，發酵后含量為236.03 μg/kg，為辣椒提供清香和草木味[28]。茴香烯是P3中唯一的特征性成分，為辣椒提供辛辣的香氣，但在新鮮辣椒中未檢出[29]。3-甲基丁酸-5-甲基己酯和4-甲基戊酸-4-甲基戊酯分別是P6和P8唯一的特征性香氣成分，賦予它們強烈的果香味[30]。

3 結 論

香味是發酵小米辣產品的重要商業品質，本研究對不同品種新鮮和發酵小米辣產品的香氣輪廓進行比較分析，并采用多元數據分析技術進一步挖掘發酵誘導產生的特征性香氣物質和導致品種風味差異的指征性香氣成分。新鮮小米辣中共檢測到56 種揮發性香氣成分，經過發酵加工后，揮發性香氣成分種類和含量均顯著增加（119 種香氣物質被檢出）。其中酯類和萜烯類物質是小米辣主要香氣成分，與以往研究結果相同[8,10,15]。在新鮮小米辣中，羅勒烯、己醛、(E)-2-己醛、正己醇、芳樟醇、水楊酸甲酯和3-甲基丁酸-4-甲基戊酯為其共有的揮發性香氣物質，而(E)-2-庚醛、1-辛烯-3-酮、(E)-2-辛烯醛、(E)-芳樟醇氧化物、水楊酸乙酯和α-松油醇為發酵誘導產生的新的共有香氣成分。OAV結果顯示1-辛烯-3-酮和己酸葉醇酯分別為新鮮和發酵小米辣中最主要的香氣物質。

通過多元數據分析發現，不同品種小米辣間的揮發性香氣成分差異明顯。發酵后小米辣形成的特征性風味，主要與萜烯類物質（α-松油醇、α-蒎烯、芳樟醇和(E)-氧化芳樟醇）、酯類物質（8-甲基-6-烯酸-4-甲基戊酯、水楊酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯）、醛類物質（(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚醛）和酮類物質（6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-庚酮）相關。另外研究發現，造成不同品種發酵小米辣呈現差異性特征風味的主要物質包括酯類物質（2-甲基丁酸芐酯、3-甲基丁酸戊酯、戊酸芐酯）和萜烯類物質（D-檸檬烯、羅勒烯、茴香烯），這些物質賦予不同品種小米辣特有的清新草木香、花香、果香和辛辣氣味。本研究以揮發性香氣成分為基礎，對比分析不同發酵小米辣的特征性香氣成分，可為發酵小米辣產品風味品質評價和品種選擇提供理論支撐，具有重要的應用價值。