基于頂空氣相離子遷移譜的干腐病馬鈴薯揮發性成分分析

張 凡，張宇帆，蘇心悅，徐文雅，安煥炯，馬倩云，孫劍鋒，王 頡，王文秀

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

馬鈴薯是世界第四大農作物，既可以作為食物，又可以作為高質量淀粉的重要來源[1]。其適應能力強，產量高，種植面積廣，是飲食中碳水化合物、維生素和礦物質的良好來源[2]。在貯藏過程中，馬鈴薯極易受到鐮刀菌的侵染而發生干腐病，導致其塊莖不斷脫水干縮，內部出現空腔、凹陷和腐爛，廣泛分布在世界馬鈴薯主產區并造成嚴重的經濟損失，目前已成為馬鈴薯貯藏期間的重要病害之一[3]。隨著鐮刀菌侵染時間的延長，不僅表面和內部組織結構發生變化，還會散發出與正常馬鈴薯不同的氣味。這些揮發性氣體物質的產生，與鐮刀菌在馬鈴薯上生長代謝，引起其自身化合物的降解密切相關。近年來，隨著智能傳感器系統的不斷發展，氣味信號作為樣品的“氣味指紋標記”，已在果蔬的病害監控方面發揮了重要的作用[4-5]。辨識干腐病馬鈴薯的特異性氣味，對于實現其早期診斷識別具有重要意義。

馬鈴薯在貯藏和腐敗過程中揮發性氣體成分多樣，不穩定性強，反應復雜，難以跟蹤其變化[6]。目前，氣相色譜-質譜聯用技術和氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術是分析揮發性化合物中常用的技術手段。其中，頂空GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GC-IMS）是近幾十年發展起來的一種用于檢測、識別和監測不同基質中痕量有機化合物的技術[7]，具有靈敏度高、定性分析準確、樣品制備簡單的特點[8-9]。目前已在酒類[10-11]、果蔬[12-14]、肉類[15-16]等物質的風味成分分析方面有所應用，此外在羊肉摻假[17]、山茶油摻假[18]、化妝品品質鑒定[19]、中藥材品種區分及成分鑒定[20-21]等方面也有所研究。然而將HSGC-IMS技術用于干腐病馬鈴薯特異性揮發性成分分析的研究鮮有報道。

針對上述問題，本研究以健康和不同病害程度的干腐病馬鈴薯為實驗原料，采用HS-GC-IMS技術對其揮發性成分進行檢測，同時結合主成分分析（principal component analysis，PCA）和指紋圖譜技術進行統計分析，全面比較不同腐敗程度馬鈴薯樣品中揮發性成分之間的差異，辯識干腐病馬鈴薯特異性揮發性成分，為基于氣味指紋圖譜信息的干腐病馬鈴薯的診斷識別提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大西洋馬鈴薯，由河北省張家口市弘基農業科技開發責任有限公司提供。

95%乙醇、85%磷酸、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白 國藥集團化學試劑有限公司；淀粉試劑盒、丙二醛試劑盒 上海優選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AR423CN電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；HH-4水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；20 mL頂空進樣瓶 上海安譜實驗科技股份有限公司；FlavourSpec?風味分析儀 山東海能科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與處理

以張家口地區干腐病馬鈴薯為對象，經組織分離及單孢純化后獲得接骨木鐮刀菌菌種，并將其在無菌環境下配制成濃度為106CFU/mL孢子菌懸液備用。

挑選表皮無任何明顯病害、外觀整齊、大小一致、表面光滑的馬鈴薯進行菌懸液的接種。在進行實驗前，將馬鈴薯清洗干凈，再用75%的乙醇溶液擦拭表面，最后用蒸餾水沖洗，置于室溫下自然晾干備用。在健康馬鈴薯表皮上制作3 個小孔，隨之將10 μL鐮刀菌的孢子菌懸液注射入孔內進行真菌侵染，從而產生馬鈴薯干腐病。為保證馬鈴薯干腐病發生，將制作的樣品放置到人工氣候箱中貯藏，其環境始終保持為24～25 ℃，相對濕度為90%。為獲取不同腐敗程度馬鈴薯樣品，每隔7 d對3 個樣品進行接種，并置于人工氣候箱中培養，至第21天時不接種，此時可獲得健康、輕度腐敗、中度腐敗和重度腐敗的馬鈴薯樣品用于HS-GC-IMS分析，每個樣品進行3 次平行實驗。健康、輕度腐敗、中度腐敗、重度腐敗的樣品分別表示為Jian-n、Qing-n、Medium-n、Zhong-n，n為樣品標號。

1.3.2 頂空進樣條件

稱取待測樣品5 g置于20 mL頂空進樣瓶中，封口。90 ℃孵育30 min后進樣，進樣針溫度為85 ℃，進樣體積為100 μL。

1.3.3 GC-IMS條件

MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，4 μm）；孵化轉速500 r/min，柱溫60 ℃，所用載氣為N2，IMS溫度45 ℃，運行分析時間20 min。載氣流量梯度設置：初始流速2 mL/min，保持2 min；2～10 min內線性升至10 mL/min；10～20 min內線性升至100 mL/min后停止。

1.3.4 理化指標的測定

可溶性蛋白質：采用考馬斯亮藍G-250染色法[22]進行測定。

丙二醛含量測定：參照丙二醛含量檢測試劑盒進行測定，其中丙二醛含量按式（1）計算：

式中：V1為反應體系總體積（8×10－4L）；V2為加入樣品體積（0.2 mL）；V3為加入提取液體積（1 mL）；ε為丙二醛摩爾吸光系數（155×103L/（mol?cm））；d為比色皿光徑（1 cm）；W為樣品質量/g，ΔA為A532－A600（吸光度）。

淀粉含量測定：參照淀粉含量檢測試劑盒法測定，按式（2）計算淀粉含量：

式中：C為稀釋倍數（25）；x為標準曲線求得的淀粉質量濃度/（mg/mL）；V為提取后體積（1.7 mL）；W為樣品鮮質量/g。

對于以上指標，每個樣品重復測定3 次，最后求其平均值。

1.4 數據處理

應用FlavourSpec?風味分析儀內置的NIST數據庫和IMS數據庫對揮發性氣體物質進行定性分析；利用軟件的配置Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖和差異譜圖）；利用Gallery Plot插件進行指紋圖譜對比，用于比較不同樣品之間的揮發性氣體物質差異；采用Dynamic PCA插件進行樣品聚類分析；利用Origin2019b對不同腐敗程度樣品的化學成分變化進行分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 不同腐敗程度樣品化學成分變化分析

在接骨木鐮刀菌侵染馬鈴薯的過程中，其含有的丙二醛、可溶性蛋白及淀粉含量會發生顯著變化。在植物處于衰老、干旱或腐敗等逆境時，組織或器官膜脂質發生過氧化反應產生丙二醛[23]，其含量與氧化程度呈正比。由圖1a可知，隨著腐敗程度的加深，丙二醛含量逐漸增大，表明接骨木鐮刀菌的侵入造成了細胞膜系統的破壞，從而導致膜氧化，最終產生了較多的丙二醛。可溶性蛋白質是食用馬鈴薯營養品質的重要組成成分[24]，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用。由圖1b可知，接骨木鐮刀菌的侵染誘導了馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白含量的增加。在侵染初期（健康～輕度），可溶性蛋白質含量升高的幅度較大，這個時期馬鈴薯塊莖中的可溶性蛋白快速積累可能與馬鈴薯對接骨木鐮刀菌產生應激反應，使塊莖內各種防御酶被激活有關[25]。如圖1c所示，隨著腐敗程度的增大，淀粉含量急劇下降，可能是由于接骨木鐮刀菌侵染馬鈴薯過程中，為了自身生長繁殖，對馬鈴薯內的營養物質進行分解和消耗，從而導致淀粉含量的減少。

圖1 不同腐敗程度馬鈴薯樣品中化學成分含量變化Fig. 1 Changes in chemical components of potato samples with different degrees of dry rot

2.2 不同腐敗程度馬鈴薯GC-IMS分析

采用HS-GC-IMS對不同腐敗程度干腐病馬鈴薯樣品中的揮發性氣體物質進行測定。將三維GC-IMS譜圖投影到二維平面，得到GC-IMS二維俯視圖，直接對不同腐敗程度馬鈴薯樣品中的揮發性成分進行對比分析。如圖2a所示，背景顏色為藍色，方框最左側紅色豎線代表反應離子峰，在其右側存在一些點，每一點都代表一種揮發性成分，顏色代表物質的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。將某類樣品中某物質最大的信號峰定義為100，據此比較其他樣品中該物質信號峰的強度，分析每種揮發性成分信號峰的相對強度，從而推斷該揮發性成分在不同樣品中的相對濃度。由圖2可知，大多數信號出現在100～500 s的保持時間和1.0～1.7 ms的漂移時間，4 種不同腐敗程度馬鈴薯樣品揮發性成分存在較大差異。

為更加明顯比較不同樣品間的差異，采用差異對比模式選取其中一個樣品的譜圖作為參比，其他樣品的譜圖扣減參比。在參比物和分析物中濃度相同的揮發性成分，背景會呈現白色，藍色表示化合物的濃度小于參考值，紅色表示化合物的濃度大于參考值。本研究以健康樣品的譜圖為參考，與其他樣品的譜圖作扣減。如圖2b所示，隨著腐敗程度的加大，紅色區域越多，代表與健康樣品揮發性成分的濃度差異較大。

圖2 不同腐敗程度馬鈴薯GC-IMS二維譜圖Fig. 2 Two-dimensional GC-IMS spectra of potato samples with different degrees of dry rot

2.3 不同病害程度馬鈴薯揮發性成分定性分析

根據離子遷移時間及保留指數對樣品揮發性化合物進行定性分析。采用和樣品相同的氣相條件測試正構酮類（C4～C9）校準液，建立保留指數（已知）和保留時間的校準曲線，對于未知物質，可通過其保留時間計算相應的保留指數。通過GC-IMS庫（NIST 2014數據庫、IMS遷移時間數據庫）進行匹配從而確定揮發性組分的種類。

圖3 4種腐敗程度樣品揮發性成分特征峰位置點Fig. 3 Position points of characteristic peaks of volatile components in potato samples with different degrees of dry rot

表1GC-IMS鑒定不同腐敗程度馬鈴薯的揮發性成分Table 1 Volatile components in potato samples with different degrees of dry rot identified by GC-IMS

續表1

如圖3所示，圖中數字標明樣品揮發性成分特征峰位置點，每個標記點代表定性分析的一種具體揮發性成分。如表1所示，從不同腐敗程度馬鈴薯樣品中共檢測出43 種揮發性成分，包括醛類18 種、醇類9 種、酮類5 種、烯烴類5 種、酯類2 種、胺類2 種、呋喃類1 種、醚類1 種，其中某些物質包括單體和二聚體。4 類樣品中共有的揮發性成分包括以下23 種：丙酮、異丁醛（單聚體）、異丁醛（二聚體）、2-甲基丁醛（單聚體）、2-甲基丁醛（二聚體）、3-甲基丁醛（單聚體）、3-甲基丁醛（二聚體）、2-庚酮、檸檬烯（單聚體）、檸檬烯（二聚體）、戊基呋喃、(E)-2-戊烯醛、正戊醛（單聚體）、正戊醛（二聚體）、2,3-丁二酮、2-丁酮、乙醛（單聚體）、乙醛（二聚體）、庚醛（單聚體）、庚醛（二聚體）、乙酸乙酯、α-水芹烯、(E)-辛烯；其中，健康樣品成分還包括：正戊醇（單聚體）、正戊醇（二聚體）、甲硫基丙醛（單聚體）、甲硫基丙醛（二聚體）、3-辛醇、苯甲醛、2-甲基丁醇（單聚體）、2-甲基丁醇（二聚體）、3-甲基丁醇（單聚體）、3-甲基丁醇（二聚體）；輕度腐敗樣品成分還包括：乙醇、庚醛（二聚體）、環己酮、正戊醇（單聚體）、正戊醇（二聚體）、甲硫基丙醛（單聚體）、甲硫基丙醛（二聚體）、3-辛醇、苯甲醛；中度腐敗樣品成分還包括：乙醇、庚醛（二聚體）、環己酮、丙胺、正戊醇（單聚體）、正戊醇（二聚體）、甲硫基丙醛（單聚體）、甲硫基丙醛（二聚體）；重度腐敗樣品成分還包括：二丙基二硫醚、苯乙烯、異丁醇、壬烯醛、乙醇、庚醛（二聚體）、環己酮、丙胺。結果表明馬鈴薯在腐敗過程中辛烯、α-水芹烯、環己酮、庚醛、乙醛含量不斷增加，且重度腐敗樣品中產生了二丙基二硫醚、苯乙烯、異丁醇、壬烯醛成分。

2.4 揮發性成分指紋圖譜對比

圖4 馬鈴薯樣品的揮發性成分指紋圖譜Fig. 4 Fingerprint of volatile components in potato samples

為更好地凸顯不同病害程度馬鈴薯樣品揮發性成分的差異，利用LAV軟件的GalleryPlot插件選取所有峰進行指紋圖譜對比，結果如圖4所示。根據指紋圖譜可以看出每種樣品的完整揮發性成分信息以及樣品之間揮發性成分的差異。

由圖4可觀察到，馬鈴薯樣品腐敗程度增大過程中揮發性成分的變化：圖中2號區域物質（戊醇、庚酮、3-辛醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、3-甲硫基丙醛和檸檬烯等）顯示揮發性成分在馬鈴薯健康時濃度最高，其可作為健康馬鈴薯的特征揮發性物質；隨著馬鈴薯干腐病病害程度的增加，圖中1號區域物質（丙酮、異丁醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛等）的含量逐漸減小；另外，圖中3號區域物質在馬鈴薯輕度腐敗時濃度最高，包括(E)-2-戊醛、2-戊基呋喃、戊醛、2,3-丁二酮和丁酮等；其中4號區域物質（己醛和乙醇等）為中度腐敗馬鈴薯樣品的特征揮發性物質。圖中5號區域物質（正丙醇、庚醛、環己酮、乙酸乙酯、二丙基二硫、2-甲基-1-丙醇、苯乙烯、α-水芹烯、(E)-2-辛醛和(E)-2-壬醛等）顯示揮發性物在馬鈴薯腐敗嚴重時濃度最高。以上研究結果表明，馬鈴薯干腐病的腐敗程度將直接影響揮發性成分的含量變化，其中辛烯、α-水芹烯、環己酮、庚醛、乙醛含量的增大代表了樣品干腐病的腐敗程度加深。

2.5 動態PCA

PCA是一種基于多元統計的檢測方法，能將高維數組進行維度壓縮，從而保留數據大量信息[26]。本研究以特征峰對應的峰強度值為參數變量，利用Dynamic PCA插件對不同腐敗程度馬鈴薯進行PCA，實現不同樣品特征差異的可視化，結果如圖5所示。前2 個PC的貢獻率分別為55%和18%，且樣品在分布圖上占據了相對獨立的空間，可以看出健康樣品和中度、重度腐敗樣品的差異較大，與輕度腐敗樣品的風味特征相對相似，但大部分也能明顯分離。

圖5 不同腐敗程度樣品的PCAFig. 5 PCA plot of potato samples with different degrees of dry rot

3 討 論

本研究利用HS-GC-IMS技術對健康和不同病害程度（輕度干腐病、中度干腐病、重度干腐病）馬鈴薯樣品中揮發性成分進行檢測，發現不同類別樣品中含有的物質種類及含量有所差異，不同腐敗程度樣品中檢測出的揮發性成分主要包括醛類、醇類、酮類、烯烴類、酯類、胺類、呋喃類、醚類等。其中醛類物質占有較大比例，其主要由脂類成分降解產生[27]，其次是由美拉德反應過程中氨基酸和糖類反應生成的呋喃及吡嗪類物質組成[28-30]。在接骨木鐮刀菌侵染新鮮馬鈴薯的過程中，隨著腐敗程度的加深，氣體物質的成分發生改變，氣體物質的種類增加，主要源于鐮刀菌的侵染造成了細胞膜系統的破壞，從而引起膜氧化，導致脂類物質降解產生更多醛類成分，尤其丙二醛的含量急劇增加。另外，淀粉作為馬鈴薯主要營養成分被消耗、分解成葡萄糖，而葡萄糖作為還原糖與氨基化合物（氨基酸和蛋白質）發生美拉德反應，從而導致更多氣體物質的產生。馬鈴薯中含有的蛋白質對氣體物質的吸附作用一定程度上決定著馬鈴薯風味品質[31-32]。在接骨木鐮刀菌侵染馬鈴薯塊莖的過程中，可溶性蛋白質為抵御接骨木鐮刀菌的侵染起到了抑制作用，隨著干腐病腐敗程度的增大，可溶性蛋白含量增加，所含有的辛烯、α-水芹烯、環己酮、庚醛、乙醛含量也增大，此現象主要源于蛋白質對一些揮發性氣體物質（酮類和醛類）具有一定促進作用[33]。

4 結 論

本研究以健康和不同腐敗程度（輕度干腐病、中度干腐病、重度干腐病）馬鈴薯樣品為研究對象，利用HSGC-IMS技術對樣品中揮發性成分進行鑒定分析，通過測定離子漂移時間和離子峰值強度，對各組分進行定性。結果表明，共檢測出43 種揮發性成分，主要包括醛類18 種、醇類9 種、酮類5 種、烯烴類5 種、酯類2 種、胺類2 種、呋喃類1 種、醚類1 種。采用指紋圖譜對不同腐敗程度樣品中揮發性成分進行分析，得到每類樣品的完整揮發性成分信息以及樣品之間揮發性成分的差異。隨著干腐病病害程度的加劇，辛烯、α-水芹烯、環己酮、庚醛、乙醛含量逐漸增大，且重度腐敗樣品中產生二丙基二硫醚、苯乙烯、異丁醇、壬烯醛成分，以上可作為與鐮刀菌代謝產物有關的特異性氣味成分。本研究利用HS-GC-IMS技術對不同病害程度馬鈴薯進行鑒別，辯識了干腐病馬鈴薯特異性揮發性成分，為基于氣味傳感信息實現馬鈴薯干腐病的診斷識別提供理論依據。