基于硫氧還蛋白還原酶1探究堆心菊靈對人前列腺癌細胞中活性氧產生的影響

潘聰桃，張曉燕，廖愛玲，潘海飛，周超峰，楊 宇*

基于硫氧還蛋白還原酶1探究堆心菊靈對人前列腺癌細胞中活性氧產生的影響

潘聰桃1，張曉燕2，廖愛玲2，潘海飛3，周超峰2，楊 宇2*

1. 溫州市中心醫院 麻醉手術科，浙江 溫州 325000 2. 溫州醫科大學附屬第一醫院 泌尿外科，浙江 溫州 325000 3. 溫州醫科大學附屬第一醫院 麻醉手術室，浙江 溫州 325000

探究堆心菊靈在人前列腺癌細胞中的抗癌作用及其潛在的作用機制。人前列腺癌DU145和PC-3細胞分別以不同濃度的堆心菊靈處理48 h，CCK-8法檢測細胞存活率；qRT-PCR法檢測硫氧還蛋白還原酶1（thioredoxin reductase 1，）mRNA表達情況。從人類蛋白免疫組化表達數據庫中檢測前列腺癌組織和正常組織中TrxR1蛋白表達情況；經堆心菊靈或活性氧（reactive oxygen species，ROS）抑制劑處理后，采用DCFH-DA染色法檢測ROS的產生；敲除或過表達，經堆心菊靈處理后，檢測2種細胞中ROS水平。堆心菊靈顯著抑制前列腺癌細胞存活率和mRNA表達水平（＜0.05、0.001），呈劑量相關性。與正常組織相比，TrxR1在前列腺癌組織中高表達。堆心菊靈顯著誘導了前列腺癌細胞中ROS的產生，敲除顯著提高了前列腺癌細胞中ROS水平，過表達TrxR1抑制了前列腺癌細胞中ROS產生；而堆心菊靈可改善TrxR1過表達對ROS產生的抑制作用。堆心菊靈可以通過靶向人前列腺癌細胞中的TrxR1來促進ROS的產生，進而發揮抗前列腺癌的作用。

堆心菊靈；硫氧還蛋白還原酶1；活性氧；前列腺癌細胞；抗癌

前列腺癌是中國男性中最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。雄激素剝奪療法是前列腺癌的首選治療方法[2]。然而，一部分前列腺癌患者對該治療不敏感，限制了該療法在臨床上的應用。因此，迫切需要探索用于治療該疾病的新型藥物。

氧化應激參與調節腫瘤細胞的惡性生物學行為。盡管從正常的生理角度來看，維持細胞功能所需的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平是必要的，但過量的ROS可能破壞促氧化劑和抗氧化劑的平衡，從而導致細胞損傷或死亡[3]。氧化應激水平的提高已成為消除腫瘤細胞的一種有前景的治療策略。與正常細胞相比，前列腺癌細胞中ROS和氧化應激水平增加[4]。研究報道，促進ROS的產生可以顯著地殺傷前列腺癌細胞[5]。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統包含硫氧還蛋白受體（thioredoxin receptor，TrxR）、Trx和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）。研究表明，抑制TrxR1的活性會破壞細胞的氧化還原平衡，從而導致ROS的升高[6]。

堆心菊靈是愈創木酚內酯的天然產物。近年來研究發現堆心菊靈具有抗炎[7]、抗氧化應激[8]和抗腫瘤[9]等多種藥理活性。然而，堆心菊靈是否能夠治療前列腺癌尚不清楚。此外，堆心菊靈抗癌的作用機制尚未完全闡明。本研究旨在探索堆心菊靈對前列腺癌細胞的影響，并探討堆心菊靈是否可以通過靶向TrxR1促進前列腺癌細胞中ROS產生。

1 材料

1.1 細胞

人前列腺癌細胞系DU145和PC-3購自美國ATCC。

1.2 藥品與試劑

堆心菊靈（批號236784P）購自孟成科技（上海）有限公司；RPMI 1640培養基（批號25123404）購自武漢普諾賽公司；胎牛血清（批號2085124A）購自美國Hyclone公司；F-12K培養基（批號2173969RP）購自美國Gibco公司；PBS溶液（批號1036741）購自美國Life Carlsbad公司；CCK-8檢測試劑盒（批號2148751）購自上海東仁化學公司；MiniBEST通用RNA提取試劑盒（批號2173969RP）購自日本Takara公司；Lipofectamine 2000（批號2036945B）購自美國Invitrogen公司；ROS檢測試劑盒（批號20210514）購自北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛（批號20210311）購自上海生工生物工程公司；山羊血清（批號04569）購自北京Beyotime公司；Triton X-100（批號20210412）、DAPI染液（批號20210311）購自美國Sigma公司。

1.3 儀器

熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；全功能微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司）；qRT-PCR儀（美國ABI公司）；細胞爬片（無錫NEST公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

DU145細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，PC-3細胞用含10%胎牛血清的F-12K培養基，培養基中均含100 U/mL青霉素和鏈霉素，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。

2.2 TrxR1過表達載體的構建

利用TrxR1特異性引物將目的基因編碼區序列（CDS）克隆，包括PCR擴增、產物純化、限制性內切酶酶切，利用T4 DNA連接酶進行連接；轉化大腸桿菌DH5a，進行菌落PCR。選取陽性樣品進行搖菌測序，比對正確的菌落保存備用，并提取質粒。

2.3 細胞存活率檢測

通過CCK-8試劑盒檢測前列腺癌細胞的存活率。DU145和PC-3細胞經PBS溶液沖洗后，用胰蛋白酶消化2 min，制成細胞懸液，將細胞以8000個/孔接種到96孔板中，細胞培養至貼壁后，向細胞中加入不同濃度的堆心菊靈（0、1、2、4、8、12、16、20 μmol/L），培養48 h；加入CCK-8溶液，孵育3 h，加入終止溶液，采用全功能微孔板檢測儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.4 轉染

DU145和PC-3細胞以1×104/孔接種到6孔板中，培養24 h后，用Liopfectamine RNAiMAX試劑將20 μmol/L si-及無關序列（si-NC）轉染到細胞中。siRNA序列：si-#1：5’-GGGGAAGACCCTGGTTGTT-3’；si-#2：5’-CCACTGTATTTACTCCTTT-3’。此外，將編碼TrxR1蛋白的重組質粒載體通過Lipofectamine 2000分別轉染到DU145和PC-3細胞中。24 h后，采用qRT-PCR評估轉染效果。

2.5 qRT-PCR檢測

使用RNA提取試劑盒從DU145和PC-3細胞中提取總RNA。用紫外分光光度計測量260/280值。將總RNA逆轉錄成cDNA：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。通過qRT-PCR檢測目標基因的表達。引物序列：人上游引物5’-CCCT- GGTTGTTGGAGCAT-3’，下游引物5’-TCTGA- GTCGGCCTGGTGT-3’；人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）上游引物5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。

2.6 ROS檢測

采用ROS檢測試劑盒檢測DU145和PC-3細胞中ROS水平。取處于對數生長期的細胞，以1×104/孔接種到24孔板中，細胞貼壁生長后，用ROS抑制劑-乙酰半胱氨酸（NAC，10 mmol/L）預處理1 h，然后加入堆心菊靈處理48 h。用無血清培養基按1∶1000稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L，將細胞與300 μL DCFH-DA于37 ℃孵育30 min；于PBS溶液中浸泡后，用4%多聚甲醛固定15 min；將載玻片用0.5% Triton X-100于室溫浸透20 min，滴加山羊血清，室溫封閉30 min；加入DAPI染液，避光孵育5 min，用載有抗熒光淬滅劑的固定溶液固定載玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。同法檢測敲除或過表達TrxR1后細胞內的ROS水平。

2.7 統計分析

3 結果

3.1 堆心菊靈抑制人前列腺癌細胞的存活率

用不同濃度的堆心菊靈處理DU145和PC-3 2種前列腺癌細胞，如圖1所示，隨著堆心菊靈濃度的增加，DU145和PC-3細胞的存活率逐漸降低。本研究選擇8 μmol/L作為堆心菊靈處理DU145細胞的最佳濃度[半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）＝6.12 μmol/L]，4 μmol/L作為堆心菊靈處理PC-3細胞的最佳濃度（IC50＝5.32 μmol/L）。

3.2 TrxR1在前列腺癌組織中高表達

從人類蛋白免疫組化表達數據庫（https://www. proteinatlas.org/）中搜索了TrxR1在人前列腺癌組織和癌旁正常組織中的表達情況。如圖2所示，TrxR1在人前列腺癌組織中染色較深，并且多位于細胞質和細胞膜上（棕黃色）；在細胞核（藍色）上沒有染色；而在癌旁正常組織中沒有著色現象。表明與癌旁正常組織相比，TrxR1在人前列腺癌組織中顯著高表達，并且TrxR1主要在細胞質和細胞膜上表達。

與堆心菊靈（0 μmol·L?1）組比較：***P＜0.001

圖2 TrxR1在人前列腺癌和癌旁正常組織中的表達情況

3.3 堆心菊靈抑制TrxR1在人前列腺癌細胞中的表達

用不同濃度的堆心菊靈處理DU145和PC-3 2種前列腺癌細胞，采用qRT-PCR檢測細胞中mRNA表達水平。如圖3所示，隨著堆心菊靈濃度的增加，DU145和PC-3細胞中mRNA表達水平逐漸降低。表明堆心菊靈可以抑制在人前列腺癌細胞中的表達，且呈劑量相關性。

與堆心菊靈（0 μmol·L?1）組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

3.4 堆心菊靈促進人前列腺癌細胞中ROS的產生

進一步分析堆心菊靈是否可以調節人前列腺癌細胞中ROS的產生，進而誘導前列腺癌細胞的凋亡。如圖4所示，與對照組相比，堆心菊靈能夠升高DU145和PC-3細胞中ROS水平；2種前列腺癌細胞經ROS抑制劑NAC預處理1 h可以明顯減弱堆心菊靈誘導的ROS升高。表明堆心菊靈促進人前列腺癌細胞中ROS的產生。

3.5 沉默TrxR1表達促進人前列腺癌細胞中ROS的產生

為了沉默的表達，設計了2個靶向TrxR1的siRNAs并分別轉染到DU145和PC-3細胞中。qRT-PCR結果（圖5-A、B）表明，2個siRNAs均有效地抑制了2種細胞中的表達，其中si-#1敲除效果更佳。因此，選取si-#1用于接下來的實驗。敲除后，通過DCFH-DA染色檢測DU145和PC-3細胞中ROS的產生，如圖5-C所示，與si-NC組相比，si-1組2種前列腺癌細胞ROS水平明顯升高。表明沉默促進人前列腺癌細胞中ROS的產生。

3.6 堆心菊靈通過靶向TrxR1促進人前列腺癌細胞中ROS的產生

為了過表達DU145和PC-3細胞中的TrxR1，將編碼TrxR1蛋白的重組質粒轉染到前列腺癌細胞中。qRT-PCR結果（圖6-A、B）顯示，TrxR1在DU145和PC-3細胞中被過表達。DCFH-DA染色結果（圖6-C）顯示，TrxR1過表達明顯抑制了前列腺癌細胞中ROS的產生，堆心菊靈能夠明顯改善前列腺癌細胞中由于TrxR1過表達導致的ROS減少。表明堆心菊靈通過靶向TrxR1促進人前列腺癌細胞中ROS的產生。

圖4 堆心菊靈促進人前列腺癌細胞中ROS的產生

qRT-PCR法檢測DU145 (A) 和PC-3細胞(B) 中siRNAs靶向TrxR1的敲除效果 經si-NC或者si-TrxR1轉染后，DCFH-DA染色法檢測DU145 (C) 和PC-3細胞(D) 中ROS的產生 與si-NC組比較：***P＜0.001

4 討論

堆心菊靈在人類多種癌細胞中均表現出有效的抗癌效果，但其對前列腺癌的作用及機制尚不清楚。本研究考察了堆心菊靈在DU145和PC-3細胞2種前列腺癌細胞中的抗癌作用，發現堆心菊靈可以通過靶向TrxR1促進前列腺癌細胞ROS的產生，進而發揮抗癌作用，表明堆心菊靈可能是一種有前景的抗前列腺癌藥物。

研究報道，MHY440可以通過ROS依賴的DNA損傷，促進胃癌細胞的凋亡和細胞周期阻滯[10]；Brosimone I可能通過ROS介導的內質網應激促進大腸癌細胞的凋亡和G1細胞周期阻滯[11]。本研究結果顯示，堆心菊靈可以誘導前列腺癌細胞中ROS的產生。研究發現，堆心菊靈可以減輕急性肝損傷小鼠中ROS的產生[8]。ROS可作為由堆心菊靈誘導的實體瘤細胞死亡的關鍵介質[12]。然而，經ROS抑制劑預處理后，堆心菊靈對前列腺癌細胞的抑制作用被減輕。因此，堆心菊靈是否通過誘導ROS的產生進而促進前列腺癌的凋亡和細胞周期阻滯，需要更多的研究來驗證。

TrxR是腫瘤的一個關鍵的治療靶點[13]。TrxR1與前列腺癌的發生和發展有關。與正常組織相比，TrxR1在前列腺癌組織顯著高表達。靶向TrxR1可以改善前列腺癌患者的預后[14]。本研究結果顯示，堆心菊靈降低了DU145和PC-3細胞中的表達，且呈劑量相關性。因此，TrxR1可能是堆心菊靈的潛在靶點。研究報道，抑制TrxR1可以誘導ROS在胃癌細胞中的積累[15]。敲低后，在DU145和PC-3細胞中發現了相似的結果；過表達TrxR1降低了ROS的產生。據報道，抑制TrxR1可以刺激乳腺癌[16]和肝細胞癌[17]的內質網應激依賴性的細胞凋亡。因此，堆心菊靈可以通過降低前列腺癌細胞中TrxR1的表達來促進ROS的產生，進而促進前列腺癌細胞凋亡。

qRT-PCR法檢測DU145 (A) 和PC-3細胞(B) 中TrxR1過表達的效果 經TrxR1過表達質粒或者堆心菊靈處理后，DCFH-DA染色法檢測DU145 (C) 和PC-3細胞(D) 中ROS的產生 與空質粒組比較：***P＜0.001

綜上所述，堆心菊靈能夠通過靶向TrxR1發揮抗前列腺癌作用，其作用機制可能與ROS介導的細胞凋亡和細胞周期阻滯有關。堆心菊靈可能是一種有前景的抗前列腺癌藥物，值得更深入的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of helenalin on reactive oxygen species in human prostate cancer cells based on thioredoxin reductase 1

PAN Cong-tao1, ZHANG Xiao-yan2, LIAO Ai-ling2, PAN Hai-fei3, ZHOU Chao-feng2, YANG Yu2

1. Department of Anesthesia Surgery, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou 325000, China 2. Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 3. Department of Anesthesia Surgery, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

To explore the anticancer effect and potential mechanism of helenalin in human prostate cancer cells.Human prostate cancer DU145 and PC-3 cells were treated with different concentrations of helenalin for 48 h, and cell viability was detected by CCK-8 method, thioredoxin reductase 1 () mRNA expression was detected by qRT-PCR method. The protein expression of TrxR1 in prostate cancer tissues and normal tissues was detected by human protein immunohistochemical expression database; After treated with helenalin or reactive oxygen species (ROS) inhibitors, the production of ROS was detected by DCFH-DA staining; Knockout or overexpression of TrxR1, ROS levels in two kinds of cells after treated with helenalin were detected.Helenalin significantly inhibited the survival rate of prostate cancer cells andmRNA expression (< 0.05, 0.001), with a concentration-dependent manner. Compared with normal tissues, TrxR1 is highly expressed in prostate cancer tissues. Helenalin significantly induced ROS production in prostate cancer cells, knockdown ofsignificantly increased ROS level in prostate cancer cells, and overexpression of TrxR1 inhibited the production of ROS in prostate cancer cells.Helenalin can promote the production of ROS by targeting TrxR1 in human prostate cancer cells, thereby exerting an anti-prostate cancer effect.

helenalin; thioredoxin reductase 1; reactive oxygen species; prostate cancer cells; anticancer

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2078 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.017

2021-12-17

溫州市科技計劃經費自籌項目（Y20180481）

潘聰桃，主管護師，本科，研究方向為泌尿系統腫瘤護理。E-mail: 435569205@qq.com

楊 宇，主治醫師，碩士研究生，研究方向為泌尿系統腫瘤。E-mail: 83292199@qq.com

[責任編輯 李亞楠]