白藜蘆醇抑制PI3K/AKT通路誘導子宮內膜癌Ishikawa細胞自噬的作用研究

范懿雋，史于傳，李 君，董 振，詹 磊

子宮內膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，約占全部生殖道惡性腫瘤的20%～30%，2018年全球新發病例有38萬例左右[1]。不同地區的發病率不同，但均隨著人口老齡化有逐步增加的趨勢[2]。外科手術結合放化療是目前最常見的子宮內膜癌臨床治療方法，鉑類和紫杉醇聯合治療是一線化療方案[3]。但是，子宮內膜癌尤其是晚期患者的諸多放化療并發癥以及不良預后嚴重困擾著臨床醫生，亟待尋找新的藥物和改良治療方法以提高患者的生存率。研究[4]發現，某些天然藥物能夠通過多種途徑如介導AMKP磷酸化增強等來調控子宮內膜癌細胞自噬，細胞自噬的增強能夠抑制癌細胞的生長并促進癌細胞凋亡。白藜蘆醇是一種多酚，在葡萄和漿果等植物中自然產生。有研究[5]發現，白藜蘆醇在人體可發揮多種功能，如抗炎、改善葡萄糖代謝和提高胰島素敏感性等。它還具有心臟保護、神經保護、抗血栓和抗癌作用。目前對于白藜蘆醇在子宮內膜癌中的作用研究較少，該研究擬通過觀察其對于子宮內膜癌細胞自噬的調控作用，探討白藜蘆醇在子宮內膜癌治療中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑白藜蘆醇購于美國Sigma公司，Beclin1、LC3B、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT抗體購于美國Abcam公司，HRP標記的二抗購于美國Affinity公司，PVDF膜購于上海Biosharp公司，ECL購于美國Pierce公司、CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司，高糖DMEM培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司，LC3 引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其它常規試劑購于武漢博士德生物工程有限公司或美國Sigma公司。

1.2 細胞培養與分組人子宮內膜癌Ishikawa細胞株(美國Sigma公司)由安徽醫科大學第二附屬醫院實驗室保存，將細胞培養于含10%胎牛血清、1% 青-鏈霉素的DMEM培養基中，細胞在含有5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養箱中培養，每3天換液1次。細胞消化處理并種植于6孔板中，待其生長至70%～80%隨機分為對照組、白藜蘆醇組和白藜蘆醇+PI3K激動劑(740Y-P)組，其中白藜蘆醇濃度為100 μmol/L。繼續培養24 h后進行相關檢測。

1.3 白黎蘆醇對Ishikawa細胞的增殖抑制作用本研究采用梯度濃度(0、25、50、100、200 μmol/L)的白藜蘆醇分別處理Ishikawa細胞24、48、72 h，通過CCK-8實驗檢測白藜蘆醇對Ishikawa細胞增殖能力的影響。具體步驟如下：將0、25、50、100、200 μmol/L白藜蘆醇處理的Ishikawa細胞分別于24、48、72 h接種在96孔板中，每孔2×103個細胞，每組3個復孔，待細胞貼壁后每孔中加10 μl的CCK-8溶液，置于培養箱內繼續孵育4 h，用酶標儀測定450 mm處吸光度值表示各組細胞的增殖情況，實驗重復3次，以實驗測得的均值為實驗結果。

1.4 電鏡觀察自噬小體Ishikawa細胞接種于6孔板中，三組細胞處理后培養24 h，用細胞刮刀收集細胞樣本，經過戊二醛鋨酸固定、梯度乙醇丙酮脫水、浸透、包埋、高溫聚合、修塊、半薄切片、染色、定位、超薄切片和醋酸鈾檸檬酸鉛染色等過程，將細胞樣本制作成為超薄切片，置于透射電子顯微鏡下，觀察細胞內自噬體的變化并拍照記錄。

1.5 Western blot法使用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，配置10%或15%的10孔膠，每孔加入10 μl的樣，電泳、轉膜、5%的脫脂奶粉封閉，然后TBST洗膜3次，每次10 min。按說明書孵一抗過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，按說明書孵二抗1 h，TBST清洗3次，每次10 min，ECL發光，顯影，以GAPDH為內參，觀測各蛋白的相對表達量。

1.6 qRT-PCR法收集加藥培養后的細胞，按照說明書使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定RNA 濃度，再利用提取RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green試劑盒開始qRT-PCR，每組樣本重復3次。GADPH 引物序列上游引物:5′-GGTTGAGCAGGTACTTT-3′，下游引物:5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′；Beclin1 引物序列上游引物:5′-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3′，下游引物:5′-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3′；LC3 引物序列上游引物:5′-AGCAGCATCCAACCAAAATC-3′，下游引物:5′-CTGTGTCCGTTCACCAACAG-3′。

1.7 免疫熒光Ishikawa細胞接種于6孔板中，三組細胞處理后培養24 h，然后開始細胞爬片，接著使用丙酮固定，固定后用PBS洗滌2次，每次10 min，山羊血清封閉，滴加抗LC3抗體過夜孵育，PBS清洗后滴加熒光二抗，使用抗熒光淬滅劑固封，最后在激光共聚顯微鏡下攝片。

2 結果

2.1 白黎蘆醇抑制Ishikawa細胞增殖在50 μmol/L濃度的白藜蘆醇培養下，Ishikawa細胞的增殖能力與對照組相比下降(P<0.01)；100 μmol/L和200 μmol/L白藜蘆醇作用下的Ishikawa細胞增殖能力與同一時段50 μmol/L組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，但100 μmol/L和200 μmol/L白藜蘆醇對細胞的抑制作用比較差異無統計學意義(P>0.05)；表明培養基中添加白藜蘆醇對Ishikawa細胞的增殖有抑制作用，并且在濃度為100 μmol/L培養24 h抑制率最高，經計算白藜蘆醇的半數抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)為94.35 μmol/L，因此，本研究采用100 μmol/L的濃度培養細胞24 h用于后續實驗。見圖1。

圖1 Ishikawa細胞白藜蘆醇作用敏感性檢測

2.2 白藜蘆醇處理可引起Ishikawa細胞自噬白藜蘆醇組細胞超微結構可見細胞核皺縮，胞質可見自噬小體，小體內包裹即將被降解的細胞器，而對照組未見細胞核皺縮和自噬小體。見圖2。

圖2 Ishikawa細胞超微結構 ×13 500

2.3 白藜蘆醇上調自噬相關蛋白Beclin1和LC3 mRNA水平與對照組比較，白藜蘆醇組Ishikawa細胞Beclin1(t=2.533,P<0.05)和LC3 mRNA水平升高(t=9.131,P<0.01)。見圖3。

圖3 兩組Beclin1與LC3 mRNA水平比較

2.4 白藜蘆醇上調自噬相關蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白水平Wester blot檢測發現，與對照組比較，白藜蘆醇組Ishikawa細胞Beclin1(t=6.258,P=0.003)和LC3-Ⅱ(t=7.489，P=0.002)蛋白水平也升高，見圖4。采用免疫熒光法檢測Ishikawa細胞LC3蛋白熒光強度，結果發現，白藜蘆醇組Ishikawa細胞質LC3蛋白紅色熒光強度強于對照組，見圖5。

圖4 兩組Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白水平比較

圖5 兩組LC3-Ⅱ蛋白表達比較 ×400

2.5 白藜蘆醇下調P-PI3K和P-AKT蛋白水平Wester blot檢測發現，白藜蘆醇組Ishikawa細胞P-PI3K(t=3.937，P=0.017)和P-AKT(t=3.502，P=0.025)蛋白水平低于對照組。見圖6。

圖6 兩組PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT 蛋白水平比較

2.6 740Y-P抑制白藜蘆醇誘導的自噬與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+740Y-P組Ishikawa細胞Beclin1(t=8.439,P<0.001)和LC3 mRNA水平降低(t=7.860,P<0.01),見圖7。進一步的檢測發現，白藜蘆醇+740Y-P組Ishikawa細胞Beclin1(t=6.817,P=0.002)和LC3-Ⅱ(t=7.846,P<0.01)蛋白水平也低于白藜蘆醇組，見圖8。白藜蘆醇組細胞超微結構可見細胞核皺縮，胞質可見自噬小體，小

圖7 三組Beclin1與LC3 mRNA水平比較

圖8 三組Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白水平比較

體內包裹即將被降解的細胞器，而白藜蘆醇+740Y-P組未見細胞核皺縮和自噬小體，見圖9。采用免疫熒光法檢測Ishikawa細胞LC3蛋白熒光強度，結果發現，白藜蘆醇組Ishikawa細胞質LC3蛋白紅色熒光強度強于白藜蘆醇+740Y-P組，見圖10。

圖9 Ishikawa細胞超微結構 ×13 500

圖10 三組LC3-Ⅱ熒光水平比較 ×400

3 討論

子宮內膜癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，肥胖、糖尿病、多囊卵巢綜合征、不孕、初潮年齡早和絕經年齡晚是潛在的危險因素。子宮內膜癌的主要發病人群是圍絕經期和絕經后婦女[5]。因子宮內膜癌篩查方法的局限性及部分患者癥狀易與圍絕經期異常子宮出血相混淆，未及時就診導致在中晚期才被發現，傳統的外科手術結合放化療并不能滿足晚期患者治療的需要[1]。天然分子在癌癥化學療法中越來越受到關注，因其與靶位點的結合作用更強，對正常細胞的毒性更小[6]。

自噬是一種保護性的分解代謝過程，通過回收細胞器和大分子來維持細胞環境的穩態[7]。在這個過程中，有缺陷或老化的細胞器和其他細胞質成分被包裹在雙囊泡內形成自噬體。自噬體與溶酶體融合，囊泡內容物被溶酶體酶降解為氨基酸、脂類和碳水化合物。降解產物被重新利用產生新的蛋白質和細胞器[8]。Beclin1是一種自噬形成過程中的信號蛋白，通過與第三類磷酸肌醇3激酶復合物的相互作用，在自噬體前體形成的過程中，發揮著巨大的作用[9]。LC3通常有LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ兩種形式，可溶性的LC3-Ⅰ通過轉化形式LC3-Ⅱ來參與自噬囊泡轉運相關的過程[10]。研究[11]表明，自噬在各種疾病的病理過程中發揮重要作用，包括神經退行性疾病、心血管疾病、腫瘤、感染和免疫缺陷等。因此，將自噬作為治療靶點在多種疾病中具有潛在意義。重要的是，已有研究[12]表明自噬對子宮內膜癌細胞的生長有抑制作用。因此，尋找促進自噬水平的方法將有利于子宮內膜癌治療。

作為一種抗毒素多酚，白藜蘆醇能夠參與多種生理和病理過程，有研究[13]表明白藜蘆醇可以抑制白血病的發生和發展，更重要的是，在有效的抗癌劑量下，白藜蘆醇對體內外正常組織的細胞毒性作用很小，這反映了白藜蘆醇在癌癥治療中的潛在價值。然而白藜蘆醇對子宮內膜癌是否有治療作用尚不明確。本研究發現，白藜蘆醇可降低Ishikawa細胞的增殖速度，隨著白藜蘆醇濃度的增加和其作用時間的延長，其對細胞生長抑制作用也逐漸增加，說明白藜蘆醇對子宮內膜癌細胞具有殺傷效應，且其作用呈現濃度與時間依賴性。通過進一步研究發現，白藜蘆醇組與對照組比較，細胞中自噬相關蛋白和其RNA 水平增加；通過細胞免疫熒光檢測，白藜蘆醇作用于Ishikawa細胞后，細胞核內的LC3藍色熒光未見區別，而細胞質LC3紅色熒光強度增強，提示自噬可能參與了白藜蘆醇的抗腫瘤作用，作用靶點主要位于細胞質。然而白藜蘆醇調控自噬的機制未明。有研究[14]表明，白藜蘆醇能夠通過PI3K/AKT信號通路對細胞的增殖遷移等活動進行調控。PI3K/AKT信號通路作為調控細胞生長的主要通路，其上調和下調對細胞的增殖等方面有著重要的意義。而且，PI3K/AKT信號通路的激活也會抑制自噬的發生[15-16]。因此，猜測在子宮內膜癌中白藜蘆醇可能通過影響PI3K/AKT通路的激活調控自噬的水平進而發揮抗腫瘤作用。通過加入白藜蘆醇的實驗組與對照組比較，白藜蘆醇作用于Ishikawa細胞后，細胞中P-PI3K和P-AKT蛋白水平下降，提示白藜蘆醇可以抑制PI3K/AKT信號通路的激活。聯合使用PI3K激動劑(740Y-P)后發現，740Y-P能夠降低白藜蘆醇誘導的自噬作用，通過Western Blot 、qRT-PCR、免疫熒光和電鏡等實驗方法對其進行了驗證。這說明白藜蘆醇可以通過抑制PI3K/AKT通路的激活來誘導Ishikawa細胞的自噬，進而抑制子宮內膜癌細胞的增殖。

綜上所述，本研究證實白藜蘆醇通過抑制PI3K/AKT信號通路，促進子宮內膜癌細胞發生自噬，從而導致增殖抑制，給子宮內膜癌治療提供了新的思路，未來可能成為子宮內膜癌輔助治療的新藥物。