miR-193a-5p/HOXA7軸對急性髓細胞白血病細胞增殖與凋亡的影響

何 迪，李 斌，喻鎂佳，陳 琪

急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種常見的血液系統惡性腫瘤，病情兇險，易復發，具有嚴重致死性，其發病率逐年上升[1]。目前AML治療進展緩慢，常用治療方法有聯合化療、誘導分化和造血干細胞移植等，盡管對AML的生物學特征的理解日漸深入，新的靶向治療藥物被研發使用，但總體生存率仍低、治療效果仍然不夠理想[2]。研究[3]表明白血病干細胞(leukemia stem cells，LSCs)是白血病細胞惡性增殖的罪魁禍首，而這些細胞具有高增殖、低凋亡、分化阻滯、耐藥等特性，導致白血病患者在放化療得到完全緩解后復發率仍非常高。因此，闡明調控LSCs增殖凋亡分子機制，對AML的治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNAs)調控多種生物學行為，如發育的進程、干細胞分化、細胞凋亡、疾病以及腫瘤發生等，近些年受到廣泛關注。miR-193a-5p作為miRNAs的一員，以同源盒基因A7(homeobox protein hox-A7,HOXA7)作為靶基因對卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等癌細胞的增殖凋亡進行調控[4-7]，但是其在AML中的作用以及對LSCs增殖凋亡的影響尚不得知。該研究在AML細胞系THP-1上探究miR-193a-5p對LSCs增殖凋亡的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 白血病骨髓樣本來自2019年1月—2021月7月云南大學附屬醫院血液內科行骨髓穿刺的52例初治AML受檢者，其中男28例，女24例；年齡34～58(41.32±4.97)歲；正常骨髓樣本來自同期血液內科行骨髓穿刺的50名健康志愿者，其中男29例，女21例；年齡31～56(43.01±5.28)歲。上述骨髓樣本的取材均獲得受檢者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2實驗材料與主要試劑 HEK293T細胞與THP-1細胞購自上海研生實業有限公司；慢病毒載體由北京博恒科創生物科技有限公司制備；質粒由北京博恒科創生物科技有限公司制備。GAPDH、Caspase-3和PARP-1抗體購自北京沃卡威生物技術有限公司；Annexin Ⅴ-PI凋亡染色試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自上海圣爾生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海弗元生物科技有限公司。

1.1.3實驗儀器 組織勻漿機購自北京中科科爾儀器有限公司；酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司；流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；光學顯微鏡購自上海光學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1熒光素酶活性檢測 HEK293T細胞用含100 g/L胎牛血清的DMEM高糖培養液，于37 ℃、50 g/L的飽和濕度條件下培養、傳代，實驗用對數生長期細胞。查找HOXA7基因序列并通過聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction,PCR)進行擴增，將擴增產物插入熒光素酶報告載體pGL3，構建野生型HOXA7載體，同時對HOXA7序列中與miR-193a-5p結合的位點進行TCACG到ATGGC的點突變，構建突變載體，按照操作說明使用轉染試劑lipofectamineTM3000將質粒與miR-193a-5p mimic或mimic-NC共轉染HEK293T細胞48 h，利用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.2THP-1細胞培養與轉染處理 THP-1細胞在37 ℃、5% CO2、含10% FBS的DMEM培養液中培養，取對數生長期的THP-1細胞株，將細胞分為空白對照組、miR-193a-5p過表達組、HOXA7 shRNA組、聯合過表達組。空白對照組細胞轉染慢病毒空載體；miR-193a-5p過表達組細胞轉染miR-193a-5p過表達慢病毒載體；HOXA7 shRNA組細胞轉染HOXA7 shRNA慢病毒載體；聯合過表達組細胞轉染miR-193a-5p過表達慢病毒載體和HOXA7過表達慢病毒載體。待細胞生長穩定后，采用實時熒光定量PCR技術和Western blot法檢測細胞內miR-193a-5p和HOXA7的表達水平，確定轉染是否成功。

1.2.3實時熒光定量PCR 骨髓樣本采用磁珠法分離骨髓細胞中的CD34+CD38-細胞。分別取分離的CD34+CD38-細胞和THP-1細胞，采用Trizol法提取心臟組織或者細胞中RNA，然后反轉錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-193a-5p和HOXA7表達水平，以GAPDH和U6作為內參。miR-193a-5p引物：上游5′-CGGAGCCAAGATTTGATCGA-3′，下游5′-GTGCGCCTGATAAGTAGCAA-3′；HOXA7引物：上游5′-ATGCACCTGCAGAGGTATAG-3′，下游5′-AGAGGAGGTTCGCAACTCTA-3′；GAPDH引物：上游5′-CGCCGTATCTGATGGCGT-3′，下游5′-CGGGAGTCTAGCAGAGTTGACTA-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′。

1.2.4Western blot檢測 分別取分離的CD34+CD38-細胞和THP-1細胞，然后加入1 ml RIPA裂解液，使用組織勻漿機對細胞進行勻漿，勻漿后的細胞放于冰上裂解5 min，之后4 ℃，在10 000 r/min速度下離心5 min，取上清液；然后往上清液中加入loading buffer(上清液體積 ∶loading buffer體積=4 ∶1)；SDS-PAGE跑膠、轉膜，轉印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，之后依次加入抗人Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、PARP-1抗體(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育12 h，然后使用HRP標記的二抗37 ℃孵育1 h，最后加入ECL發光液曝光檢測。

1.2.5CCK-8檢測 收集穩定轉染的THP-1細胞，使用CCK-8試劑盒檢測各組的THP-1細胞增殖情況，具體步驟如下：將穩定轉染的細胞接種到96孔板中，待細胞生長80%時，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.6細胞計數 取培養板中培養細胞，在顯微鏡下對各組培養孔中細胞進行拍照，然后收集細胞，離心，棄培養基，用PBS重懸細胞，然后使用細胞計數儀對各組細胞數量進行計數。

1.2.7THP-1細胞凋亡檢測 將穩定轉染的細胞接種到96孔板中，待細胞生長至實驗截止時，收集細胞，然后立即使用Annexin Ⅴ-PI凋亡染色試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒并采用綠色FITC標記熒光檢測法對分離的細胞進行染色。流式細胞術分析：使用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行分析，采用固定流速(6 ml/min)，收集1 min，Q1+Q2+Q3細胞即為發生凋亡的細胞。TUNEL染色分析：具體方法參照試劑盒說明書，通過光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況。

2 結果

2.1 各組熒光素酶活性比較熒光素酶檢測顯示，miR-193a-5p mimic能夠降低HOXA7野生型熒光素酶活性(P<0.01)，而對HOXA7突變型熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表1。

表1 各組熒光素酶活性比較

2.2 AML患者骨髓細胞中miR-193a-5p及HOXA7表達水平變化AML骨髓CD34+CD38-細胞中miR-193a-5p表達水平低于健康志愿者骨髓CD34+CD38-細胞中水平，而AML骨髓CD34+CD38-細胞中HOXA7 mRNA和蛋白表達水平高于健康志愿者骨髓CD34+CD38-細胞中水平(P<0.01)，見圖1。

圖1 AML患者骨髓細胞中miR-193a-5p及HOXA7表達水平變化

2.3 各組THP-1細胞中miR-193a-5p及HOXA7表達水平變化miR-193a-5p過表達組和聯合過表達組THP-1細胞中miR-193a-5p表達水平高于空白對照組(P<0.01)；聯合過表達組THP-1細胞中HOXA7 mRNA和蛋白表達水平高于空白對照組，而miR-193a-5p過表達組及HOX7A shRNA組HOXA7 mRNA和蛋白表達水平低于空白對照組(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組THP-1細胞中miR-193a-5p及HOXA7表達水平變化

2.4 各組THP-1細胞增殖情況比較與空白對照組比較，miR-193a-5p過表達組及HOXA7 shRNA組THP-1細胞增殖受到抑制且細胞數量減少(P<0.05)；聯合過表達組THP-1細胞增殖以及細胞數量優于空白對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組THP-1細胞增殖情況比較

2.5 各組THP-1細胞凋亡情況比較miR-193a-5p過表達組及HOXA7 shRNA組THP-1細胞凋亡比例高于空白對照組，且HOXA7 shRNA組THP-1細胞凋亡比例高于miR-193a-5p過表達組(P<0.01)；聯合過表達組THP-1細胞凋亡百分比分別低于空白對照組、miR-193a-5p過表達組及HOXA7 shRNA組(P<0.01)，見圖4。

圖4 各組THP-1細胞凋亡情況比較

2.6 各組THP-1細胞凋亡蛋白表達情況比較miR-193a-5p過表達組及HOXA7 shRNA組THP-1細胞活化的Caspase-3和PARP1量高于空白對照組，且HOXA7 shRNA組THP-1細胞活化的Caspase-3和PARP1量高于miR-193a-5p過表達組(P<0.01)；聯合過表達組THP-1細胞活化的Caspase-3和PARP1量分別低于空白對照組、miR-193a-5p過表達組及HOXA7 shRNA組(P<0.01)，見圖5。

圖5 各組THP-1細胞凋亡蛋白表達情況比較

3 討論

近年來，miRNAs在AML發生與發展過程中的作用受到了廣泛關注。作為miRNA的一員，miR-193a-5p在腫瘤細胞增殖、生長過程中展現出較為重要作用。研究[8-10]表明，miR-193a-5p在卵巢癌、肝癌、胃癌等腫瘤細胞中表達水平降低，且上調腫瘤細胞中miR-193a-5p水平后可有效抑制腫瘤細胞增殖，表明miR-193a-5p具有調控腫瘤細胞增殖的能力。研究[11]表明，AML初發和復發患者血漿miR-193a-5p表達水平低于緩解AML患者或健康受試者血漿水平，但miR-193a-5p在LSCs增殖生長過程中的作用尚不得知。

HOXA7作為HOX基因家族的一員，是造血細胞增殖分化的主控基因。研究[12]表明，HOXA7在白血病中的表達及功能受多種上游因子的調控，可在各種協同作用分子或HOX基因的影響下作用于下游靶基因，參與白血病的發生發展。HOXA7可影響白血病的臨床表現，且其表達水平與白血病的治療與預后有較大關聯[13]。此外，HOXA7在腫瘤細胞增殖過程中扮演重要角色[14]。生物信息學分析發現，HOXA7是miR-193a-5p直接作用的靶分子。miR-193a-5p通過結合HOXA7基因的TCACG位點，調節HOXA7的mRNA及蛋白表達水平。本研究的熒光素酶活性檢測發現，miR-193a-5p不影響結合位點突變的HOXA7熒光素酶活性，卻能降低野生型HOXA7熒光素酶活性，實驗證明miR-193a-5p具有調控HOXA7的功能。AML患者和健康受試者骨髓中LSCs(CD34+CD38-細胞)miR-193a-5p表達水平的比較結果顯示，AML患者骨髓CD34+CD38-細胞內miR-193a-5p表達水平降低，而HOXA7表達水平升高。

進一步THP-1細胞培養結果顯示，過表達miR-193a-5p或抑制HOXA7表達能夠抑制THP-1細胞增殖、促進THP-1細胞凋亡蛋白Caspase-3和PARP1活化及細胞凋亡，這與之前研究人員[15]關于HOXA7的功能相一致。但是同時過表達miR-193a-5p和HOXA7時，miR-193a-5p對THP-1細胞增殖及凋亡的影響作用則消失，甚至同時過表達miR-193a-5p和HOXA7時反而進一步促進了THP-1細胞增殖，THP-1細胞凋亡則被抑制。考慮到HOXA7具有促進腫瘤細胞增殖的功能，發生這種現象的解釋是miR-193a-5p可通過抑制HOXA7的表達繼而抑制THP-1細胞增殖及促進細胞凋亡，同時過表達HOXA7時抵消了miR-193a-5p的生物學作用，而過表達的HOXA7進一步促進了THP-1細胞的增殖生長。

綜上所述，miR-193a-5p在AML患者骨髓細胞中表達量降低，其可通過抑制HOXA7表達抑制THP-1細胞增殖、促進THP-1細胞凋亡。本研究為臨床治療AML提供了新的思路。