CCL20通過ERK通路促進食管鱗癌細胞遷移和侵襲

南紅星，禹劉麗，王良海

食管癌作為全球病死率排名第6位的惡性腫瘤，每年有近51萬例患者死亡[1]，其中約一半為中國患者[2]。食管鱗癌是國內食管癌的主要病理亞型，隨著生活條件的改善和醫療水平的提高，食管鱗癌患者的病死率有所降低，但轉移性食管鱗癌患者的預后仍不理想[3]。轉移成為食管鱗癌患者預后差的主要原因之一，尋找食管鱗癌轉移發生的潛在機制，對提高食管鱗癌患者的生存有積極意義。趨化因子是一類小細胞因子，可以誘導特異細胞趨化轉移，一系列趨化因子被報道參與腫瘤的惡性進展[4-5]，其中CCL20不僅在黑色素瘤、結直腸癌等惡性腫瘤轉移過程中發揮作用[4,6]，還在多種腫瘤中高表達，并且和腫瘤分級以及患者的累積生存時間密切相關[7]。但是CCL20在食管鱗癌中的研究卻很少，該研究探討CCL20對食管鱗癌細胞惡性的影響，并初步探索了CCL20的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌細胞株：ECA109和EC9706來源于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。主要試劑： RMPI 1640培養液和超敏ECL底物發光試劑盒購自于美國Thermo Fisher公司，G418藥物及Western blot實驗試劑購自中國索萊寶科技有限公司，胎牛血清生產于以色列 Bioind公司，ERK、NF-κB、STAT3 和AKT信號通路抑制劑購自美國Selleck公司，CCK8試劑購自北京北仁化學科技有限公司，Transwell小室及Matrigel 基質膠購自美國Corning公司，CCL20抗體(1 ∶1 000,# ab9829)購自英國Abcam抗體公司，p-ERK1/2(1 ∶1 000,#4370) 抗體及ERK1/2(1 ∶1 000,#4695)抗體購自美國CST公司，所有使用質粒均合成于中國吉瑪公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染 使用含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養基培養ECA109和EC9706細胞。含有CCL20的質粒和靶向CCL20的shRNA(shCCL20)質粒使用Lipofectamine 2000轉染進細胞，CCL20過表達組為轉染了CCL20質粒的細胞，CCL20干擾組是轉染了shCCL20質粒的細胞，轉染空載體的細胞為對照組。轉染后使用濃度為500 ng/L的G418 藥物篩選轉染細胞，之后通過 Western blot或者實時定量PCR實驗驗證轉染效果。

1.2.2蛋白提取與Western blot實驗 使用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細胞20 min，4 ℃條件下13 000 r/min離心20 min，取離心上清測濃度。電泳到蛋白分離開，用半干轉儀器轉膜，室溫搖床封閉膜2 h后，于4 ℃結合一抗過夜。二抗結合2 h后洗膜曝光。

1.2.3實時定量PCR 提取總RNA，逆轉錄，PCR擴增后，檢測CCL20 mRNA的表達水平，β肌動蛋白作為對照，使用的引物序列CCL20 F：5′-GCGAA TCAGAAGCAAGCAACT-3′， R:5′-TTGGATTTGCGC ACACAGAC-3′；β-actin F:5′-AAGGATTCCTATGTGG GCGAC-3′，R:5′- CGTACAGGGATAGCACAGCC-3′。

1.2.4Transwell 遷移與侵襲實驗 上室加細胞懸液200 μl，遷移實驗接種細胞數目為3×104個/孔，侵襲實驗接種細胞數目為1.5×104個/孔，下室為含20%胎牛血清的1640培養基，胎牛血清作為化學誘導物。遷移實驗培養時間為1 d，侵襲實驗培養時間為2 d。侵襲實驗的小室需要用45 μl 稀釋的基質膠包被。Transwell遷移和侵襲實驗小室置于200×放大率的鏡下，隨機拍取至少5張結晶紫染色細胞圖片，計數后統計分析。

1.2.5CCK8實驗 鋪96孔板后，于0、24、48和72 h時每孔加入CCK8試劑10 μl，放回培養箱2 h后，酶標儀檢測各孔吸光度。

2 結果

2.1 過表達CCL20對食管鱗癌細胞運動能力的影響

2.1.1建立CCL20過表達細胞株 與對照組細胞比較，過表達CCL20的ECA109細胞和EC9706細胞表達的CCL20蛋白增多，表示CCL20過表達細胞株成功建立。見圖1。

圖1 Western blot 實驗檢測過表達CCL20后ECA109和EC9709細胞中CCL20蛋白的表達情況

2.1.2CCL20對食管鱗癌細胞遷移的影響 與對照組細胞比較，過表達CCL20的ECA109細胞和EC9709細胞遷移穿過聚碳酯膜的細胞數目增多[(49.73±23.02)個vs(178.80±36.79)個][(108.40±25.16)個vs(43.40±8.52)個]，差異有統計學意義(t=5.15、4.239，P<0.01、<0.05)，表明過表達CCL20增加食管鱗癌細胞遷移能力。見圖2。

圖2 過表達CCL20對食管鱗癌細胞遷移的影響 ×200

2.1.3CCL20對食管鱗癌細胞侵襲的影響 與對照組細胞比較，過表達CCL20的ECA109細胞和EC9709細胞侵襲穿過Transwell膜的細胞數目增多[(160.70±14.64)個vs(38.13±14.85)個][(251.20±34.02)個vs(67.47±11.04)個]，差異有統計學意義(t=10.17、8.901,均P<0.001)，表明過表達CCL20增加食管鱗癌細胞侵襲能力。見圖3。

圖3 過表達CCL20對食管鱗癌細胞侵襲的影響 ×200

2.2 CCL20對食管鱗癌細胞增殖的影響過表達CCL20的ECA109和EC9706細胞吸光度在24 h(0.380±0.024)(0.316±0.012)，48 h(0.768±0.014)(0.462±0.005)和72 h(1.496±0.133)(0.858±0.031)時，與對照組細胞吸光度24 h(0.344±0.012)(0.286±0.009)，48 h(0.657±0.009)(0.447±0.004)和72 h(1.323±0.0587)(0.7886±0.0386)比較，差異無統計學意義(t=2.264、 11.680、 2.067，均P>0.05)(t=3.450、3.984、2.431，均P>0.05)，提示CCL20對食管鱗癌細胞的增殖無明顯影響。見圖4。

圖4 CCK8實驗檢測過表達CCL20后對食管鱗癌細胞增殖的影響

2.3 干擾CCL20對食管鱗癌細胞運動能力的影響

2.3.1建立CCL20干擾細胞株 靶向CCL20的3組shRNA(shCCL20#1、2、3)均能降低EC9706細胞中的CCL20 mRNA的表達水平，尤其shCCL20#3組干擾效率最高。見圖5。

圖5 實時定量PCR實驗顯示不同shCCL20質粒的干擾效果

2.3.2干擾CCL20表達對食管鱗癌細胞遷移侵襲的影響 與對照組細胞比較，干擾CCL20表達的EC9706細胞遷移和侵襲穿過Transwell聚碳酯膜的細胞數目均降低[(75.67±9.74)個vs(28.20±4.74)個][(81.00±13.67)個vs(24.57±8.36)個]，差異有統計學意義(t=7.590、6.101,均P<0.01)，提示干擾CCL20表達后食管鱗癌細胞遷移侵襲能力下降。見圖6。

圖6 干擾CCL20表達對食管鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響 ×200

2.4 CCL20的下游通路探討

2.4.1抑制ERK通路對食管鱗癌細胞遷移侵襲的影響 ERK1/2特異性抑制劑(SCH772984)(1 μmol/L)處理EC9706細胞1～2 d后， 與CCL20組比較，CCL20+抑制劑組遷移和侵襲通過Transwell小室膜的細胞數目減少[(208.30±42.13)個vs(83.00±21.82)個][(212.70±72.53)個vs(53.43±9.93)個]，差異有統計學意義(t=4.575、3.769,均P<0.05)。四組間差異有統計學意義(F=18.94、17.22,P<0.001)，見圖7。

圖7 抑制ERK通路對食管鱗癌細胞遷移侵襲能力的影響 ×200

2.4.2過表達或者干擾CCL20對ERK蛋白的影響 與對照組細胞比較，過表達CCL20的 EC9706細胞中ERK1/2蛋白磷酸化激活水平增加，干擾CCL20表達后， ERK1/2蛋白的磷酸化激活水平下降。見圖8。

圖8 過表達或者干擾CCL20對ERK蛋白的影響

3 討論

轉移和復發一直是食管鱗癌患者死亡的主要原因，關于腫瘤轉移的研究很多，然而至今也不能完全闡明腫瘤轉移的分子機制。但是腫瘤細胞的轉移和趨化因子有密切關系，趨化因子可以通過招募特異型免疫細胞進入腫瘤微環境[8]，為腫瘤細胞轉移定植后的存活提供支持，還可以促進腫瘤的惡性進展。

CCL20和其它趨化因子一樣，可以介導免疫細胞的趨化轉移，在腫瘤免疫過程中發揮作用。有研究[9]報道CCL20可以招募Treg細胞增強結直腸癌的化療抵抗，在食管鱗癌中，CCL20可以招募Treg細胞促進食管鱗癌的進展，并且CCL20表達高的患者的預后更差[10]。另外，CCL20在多種腫瘤中作為危險因子促進腫瘤的進展，例如促進喉癌細胞的增殖和轉移[11]，在乳腺癌中促進腫瘤細胞侵襲和遷移[12]。但是未發現CCL20與食管鱗癌轉移的相關研究，本研究對CCL20在食管鱗癌細胞中的作用及其潛在的分子機制進行了初步探索，發現過表達CCL20后，食管鱗癌細胞的遷移和侵襲能力增強，干擾CCL20的表達可以抑制食管鱗癌細胞遷移和侵襲，表明CCL20可以增強食管鱗癌細胞的運動能力，增加食管鱗癌細胞的轉移潛能。為了尋找CCL20促進食管鱗癌細胞運動的下游信號通路，本研究檢測了ERK信號通路特異性抑制劑(SCH772984,1 μmol/L)處理對食管鱗癌細胞侵襲遷移的影響，結果ERK1/2特異性通路抑制劑處理顯著降低了食管鱗癌細胞的遷移和侵襲能力，這意味著CCL20可能是通過ERK通路促進食管鱗癌細胞遷移和侵襲。為了驗證實驗結果，Western blot實驗檢測了過表達CCL20后ERK1/2蛋白的變化，發現過表達CCL20后，ERK1/2蛋白的磷酸化水平增加，干擾CCL20的表達后，ERK1/2的磷酸化水平降低，這些結果表明過表達CCL20后，ERK通路異常激活，干擾CCL20后，ERK通路的激活受到抑制，進一步印證了CCL20通過激活ERK通路促進食管鱗癌細胞遷移和侵襲的實驗結果。本研究增加了人們對食管鱗癌轉移潛在機制的了解，提示CCL20可能在食管鱗癌轉移過程中發揮重要作用，為食管鱗癌患者的治療提供了新的方向。