索拉非尼對人RKO結腸癌細胞增殖、周期及凋亡的影響

劉蒙蒙，倪謙枝，李晶晶，謝 東，陳天偉，高振軍，黃繼英，莊一心

結腸癌是全球第三大常見腫瘤，隨著居民生活水平的提高及飲食習慣的改變，其國內發病率排在惡性腫瘤和致死因素的第四位，且正逐步攀升[1]。目前治療結腸癌的手段主要為手術切除、放化療、中醫治療和靶向治療。手術和放化療對進展期的結腸癌治療效果不理想，而靶向治療逐漸成為治療結腸癌的熱點[2]。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，其主要通過受體酪氨酸激酶抑制腫瘤生長和血管生成，是晚期肝細胞癌患者為數不多的全身治療方案[3-4]。研究[5]表明索拉非尼可通過PI3K/AKT/mTOR信號通，抑制肝癌細胞的增殖。該研究探究索拉非尼對人結腸癌RKO細胞的增殖抑制作用及其可能作用機制，為將來臨床采用索拉非尼治療結腸癌提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料人結腸癌RKO細胞購自中國科學院細胞庫，DMEM及胎牛血清FBS購自美國Thermo Fisher公司，凋亡檢測試劑盒購自美國BD Pharmingen公司，caspase-3、caspase-8、PARP和GADPH一抗抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，索拉非尼片購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1MTT增殖檢測 將人腸癌RKO細胞穩定培養后消化、傳代，96孔板中每孔中加入1×104個/ml人腸癌RKO細胞懸濁液200 μl。貼壁后，更換完全培養基，添加不同濃度(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)索拉非尼，對照組為二甲基亞砜處理。培養48 h 后，MTT法測定490 nm吸光度值。取索拉非尼的半數抑制濃度(the half inhibition of concentration，IC50)組為實驗組。

1.2.2細胞克隆形成 針對上述對照組及實驗組處理細胞，于6孔板中每孔中加入1 500個人腸癌RKO細胞，培養10 d后，棄去上清液，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色15 min。

1.2.3流式檢測細胞凋亡及細胞周期 針對實驗組及對照組，用胰蛋白酶法收獲細胞。在FITC-Annexin V和碘化丙啶雙重染色后，使用FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。使用cycle TEST PLUS DNA試劑盒對細胞進行碘化丙啶染色后，通過流式細胞儀進行細胞周期檢測，并通過FACScan軟件進行分析。

1.2.4Western blot檢測凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-8和PARP表達 使用含有蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液裂解細胞，BCA蛋白分析試劑盒對提取的總蛋白濃度進行定量，10% SDS-PAGE凝膠分離等量的總蛋白，然后轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜與對應的一抗抗體(caspase-3、caspase-8和PARP)在4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶結合山羊抗兔二抗在室溫下以1 ∶5 000的稀釋度作用1 h，并且使用Pierce ECL Western印跡底物檢測蛋白質信號。

2 結果

2.1 不同濃度索拉非尼對結腸癌RKO細胞增殖的影響MTT檢測RKO細胞增殖，結果顯示索拉非尼對RKO細胞具有抑制作用，并呈濃度依賴的關系(圖1A)。索拉非尼對RKO細胞株作用的IC50為10.0 μmol/L。克隆形成實驗結果顯示，索拉非尼(10.0 μmol/L)對細胞增殖具有抑制作用(P<0.001，圖1B)。

圖1 不同濃度索拉非尼對結腸癌RKO細胞增殖的影響

2.2 索拉非尼對結腸癌細胞RKO凋亡的影響通過Annexin V-FITC/PI 法測定兩組凋亡率，結果顯示實驗組細胞凋亡率為(32.53±6.64)%，對照組凋亡率為(4.47±2.09)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。

圖2 索拉非尼對結腸癌細胞RKO凋亡的影響

2.3 索拉非尼對結腸癌細胞RKO周期的影響PI法檢測兩組細胞周期，結果顯示實驗組RKO細胞處于G1期的比例為(56.92±2.25)%，G2期比例為(14.94±5.01)%，S期比例為(28.14±3.04)%；對照組處于G1期細胞的比例為(24.53±1.70)%，G2期比例為(31.70±2.88)%，S期比例為(43.77±1.19)%；RKO的三個細胞時期比例均有變化(P<0.01，圖3)。

圖3 索拉非尼對結腸癌細胞RKO周期的影響

2.4 索拉非尼對結腸癌細胞RKO凋亡相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，實驗組凋亡關鍵蛋白酶caspase-3和caspase-8表達水平高于對照組，并且caspase-3激活指示蛋白PARP的表達水平同樣高于對照組(P<0.05，圖4)。

圖4 索拉非尼對結腸癌細胞RKO凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

結腸癌是病死率最高的三大消化系統腫瘤之一，確診病例中約50%～60%的腫瘤發生轉移，預后很差[6-7]。化療被認為是結腸癌患者的標準治療方法，但化療的局限性不容忽視，如選擇性低、在腫瘤組織中濃度不足、全身毒性等[8]。所以挖掘腫瘤有效治療靶標具有重要的臨床指導價值。

索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，是美國食品藥品監督管理局于2007年批準的首個治療肝癌的一線全身治療藥物。索拉非尼具有多種作用部位，抑制VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR-β、RAF家族激酶[9]。在具有里程碑意義的臨床Ⅲ期試驗中，針對602例肝癌患者，與安慰劑比較，索拉非尼提高了中位總生存期(10.7個月vs7.9個月，P<0.001)[10]。作為一種多功能抑制劑，索拉非尼具有抑制腫瘤生長、進展、轉移、血管生成和下調機制的潛力，可保護腫瘤不受凋亡的影響。

Liu et al[11]證實索拉非尼通過ATP-AMPK-mTOR-SREBP1信號通路阻斷SCD1介導的單不飽和脂肪酸的合成，從而殺死肝癌細胞。Gounder et al[12]針對87例進行性、癥狀性或復發性硬纖維瘤患者，接受索拉非尼(400 mg/片，每天一次)或安慰劑，在平均27.2個月的隨訪中，索拉非尼組2年無進展生存率為81%(95%CI為69%～96%)，安慰劑組為36%(95%CI為22%～57%)(進展或死亡危險比為0.13，95%CI為0.05～0.31，P<0.001)，研究表明在進行性、復發性或有癥狀的硬纖維瘤患者中，索拉非尼延長無進展生存期并誘導持久反應。Corrado et al[13]證實索拉非尼在體內外對甲狀腺癌細胞具有抗增殖和抗血管生成作用。所以，本研究嘗試探索索拉非尼對人RKO腸癌細胞的抑制作用及其可能機制。

本研究結果表明，索拉非尼對結腸癌RKO細胞有增殖抑制和促凋亡作用，而且隨著索拉非尼濃度增加，對RKO細胞的抑制效果越明顯。同時發現，索拉非尼主要是通過增加caspase-8、caspase-3以及PARP的表達來促進結腸癌細胞的凋亡。在腫瘤中，常見調節細胞周期機制和頻率元件的錯亂反映出異常的細胞周期對腫瘤惡性增殖表型的重要性[14]。長期以來，靶向細胞周期被視為一個潛在的治療的靶點，但由于早期細胞周期抑制劑特異性較低，限制了這種靶向抑制的發展[15]。本研究發現索拉非尼對腸癌細胞RKO的細胞周期有影響，索拉非尼處理之后，G1期細胞增多，而S期和G2期細胞減少，說明索拉非尼可以將RKO細胞阻斷在DNA合成前期，從而抑制細胞增殖。

綜上所述，本研究發現索拉非尼對結腸癌RKO細胞增殖有抑制作用，而且和使用的濃度呈正相關。索拉非尼通過促進RKO細胞的凋亡來抑制結腸癌細胞的增殖。同時，本研究還發現索拉非尼會影響RKO細胞的細胞周期。這為將來用索拉非尼治療結腸癌提供一定的參考價值。