慢性不可預知應激所致抑郁小鼠性行為受損及VTA腦區(qū)BDNF的表達下降

王 丹，邱長云，孟凡濤，趙 娣，劉翠蘭，劉 晶，李 晨，王文濤

性愛行為對于物種延續(xù)是必不可少的，嗅覺運動發(fā)生在行為交互中，并引導性行為的發(fā)生[1]。嚙齒類動物中，嗅覺幫助動物發(fā)現(xiàn)配偶，決定它們的行為輸出[2]，對動物嗅覺行為的檢驗可作為評價小鼠性相關行為的指標[3]。腹側被蓋區(qū)(ventral tegmental area, VTA)是調控性獎賞行為的主要腦區(qū)。VTA-多巴胺環(huán)路系統(tǒng)處理動機以及與社會獎賞相關的需求[4-6]。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是大腦中含量最豐富、分布最廣的一種神經營養(yǎng)因子，研究報道BDNF能夠調控動機行為和影響性行為[7-9]，性行為也能影響VTA腦區(qū)BDNF的表達[10]。但是，慢性不可預知應激(chronic unpredictable stress，CUS)致小鼠抑郁后，小鼠性行為表現(xiàn)及VTA腦區(qū)BDNF的表達尚未報道。該研究利用CUS小鼠抑郁模型，結合性相關行為測定方法及綜合運用免疫熒光、Western blot、熒光定量PCR的方法檢測VTA腦區(qū)BDNF的變化，為研究抑郁降低小鼠性相關行為提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 20只C57BL/6J雄鼠，從美國Jackson實驗室購買，并在SPF級動物房進行繁殖飼養(yǎng)，小鼠3～5只/籠，自由飲水和飲食，環(huán)境溫度19～22 ℃，相對濕度40%～60%，維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)律。小鼠飼養(yǎng)到8周后開始進行實驗，實驗動物許可證：SYXK(魯)2018 022，所有行為學實驗均于濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物行為學實驗室進行。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗BDNF單克隆抗體(英國Abcam公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國Cell signaling公司)；鼠抗TH抗體(美國immunostar公司)；羊抗兔二抗IR Dye800CW，驢抗鼠二抗IR Dye680LT，ALexa fluor 488山羊抗兔熒光二抗、ALexa fluor 546驢抗鼠熒光二抗(美國Thermo Fisher公司)。雙紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey Sa(美國Li-COR公司)。共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯有限公司(FV1200)。總RNA提取試劑盒(美國Omega公司)；RNA反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；Real-time PCR儀(StepOnePlus)(美國麻省ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗步驟 小鼠隨機分為Control組和CUS組，每組10只。CUS組單籠飼養(yǎng)，方法參照文獻[11]，對照組3～5只/籠，不給于任何干預，放置在另一房間。CUS結束后，小鼠進行糖水偏好實驗和強迫游泳實驗檢測CUS的效果；通過嗅覺偏好測試和雌鼠尿液嗅實驗檢測CUS對小鼠性行為的影響。小鼠進行自主活動實驗檢測小鼠的活動能力。最后小鼠斷頭取腦，提取小鼠VTA腦區(qū)組織，檢測BDNF蛋白及mRNA的水平。

1.2.2CUS抑郁模型的建立 CUS抑郁模型參考文獻的方法[11]，CUS組給予21 d CUS結合單籠飼養(yǎng)：第1、8、15天束縛2 h，第2、9、16天給與24 h光照，第3、10、17天電擊10 min(0.3 mA電擊2 s，間歇16 s，共10 min)，第4、11、18天夾尾15 min，第5、12、19天高臺30 min，第6、13、20天給與24 h濕盒并傾斜45°，第7、14、21 天冷水游泳(8 ℃)。整個應激在盡力減少小鼠不舒適性的前提下讓刺激達到最大的不可預知性，應激結束后經抑郁樣行為實驗評判模型是否成功。

1.2.3糖水偏好實驗 小鼠在進行糖水偏好實驗前先適應雙瓶水1周。然后小鼠在居住籠中進行測試，測試前小鼠剝奪飲水5 h，然后小鼠籠中一側放平時用的飲水，另一側放置飲水配置的1%的蔗糖水，測試夜間12 h內小鼠攝取的飲水量和糖水量，然后計算糖水偏好指數(shù)(糖水偏好指數(shù)=糖水消耗/總液體消耗×100%)，糖水偏好指數(shù)反映小鼠快感缺乏程度。

1.2.4強迫游泳實驗 小鼠在測試房間適應2～3 h后開始進行強迫游泳實驗，實驗裝置為一個高度25 cm、直徑10 cm的透明樹脂圓筒，實驗時注入深度為15 cm、溫度為24 ℃的自來水，將小鼠放置進水中，放置小鼠時要避免小鼠頭部入水，用攝像頭記錄小鼠6 min的行為視頻，其中前2 min為小鼠適應階段，分析小鼠后4 min的靜止不動時間。以小鼠在絕望環(huán)境中試圖逃脫又無法逃脫的狀態(tài)評判小鼠的抑郁程度，每只小鼠都需更換新水。

1.2.5自主活動實驗 小鼠在測試房間適應2～3 h后開始進行自主活動測試。小鼠放置在40 cm×40 cm×40 cm的曠場裝置中自由探索30 min，通過裝置上方攝像頭跟蹤記錄小鼠的運動，然后通過Anymaze軟件對小鼠運動的距離進行分析。

1.2.6嗅覺偏好測試 參照文獻[12]的方法測試前先要進行適應1 d，小鼠放置于裝置中自由探索15 min，允許它們能夠自由探索整個裝置，以便排除對一側有偏好的小鼠。接下來的2 d，測試小鼠在此裝置中對發(fā)情期雌鼠污染過的墊料或者雄鼠污染過的墊料以及干凈墊料的偏好(墊料的順序需要在小鼠之間進行平衡)。10 min適應之后，30 ml干凈的墊料放置于一側的塑料杯中，另一側放置相同量的污染過的墊料，兩個塑料杯分別放在2個箱室的一個角落。小鼠自由探索5 min。記錄小鼠分別與兩個杯子交互的時間和在兩側箱室的時間，通過Anymaze軟件對小鼠運動的軌跡進行記錄。

1.2.7雌鼠尿液嗅實驗 實驗開始前，小鼠單籠適應2～3 h。然后籠子中放入一個滅菌的棉簽適應1 h。整個實驗都要在燈光昏暗的房間進行，亮度為3 lux。實驗開始后小鼠籠中放置蘸有水的棉簽測試3 min，測試蘸有水的棉簽45 min后，小鼠籠中放置蘸有來自發(fā)情期雌鼠的尿液的棉簽測試3 min。3 min測試期間記錄小鼠嗅聞棉簽的時間。實驗中需要排除在籠中不動，不聞嗅棉簽的小鼠。

1.2.8Western blot CUS結束后，小鼠斷頭，并在冰上迅速分離海馬，置液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕龊ｑR用含1% PMSF的RIPA裂解液進行裂解，然后加入5×上樣染料，沸水煮10 min，然后用12%或15%的SDS-PAGE膠進行分離，并轉到PVDF膜上，膜用TBST buffer(20 μmmol/L TRIs-HCl，pH7.4，150 μmmol/L NaCl，0.1% Tween-20)配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，然后經過一抗(兔抗BDNF 1 ∶500，鼠抗β-actin 1 ∶1 000)過夜孵育，加熒光二抗(羊抗兔1 ∶5 000，驢抗鼠1 ∶5 000)室溫孵育1 h，經Odyssey Sa雙紅外激光成像系統(tǒng)成像并進行灰度識別分析。

1.2.9免疫熒光 腦片制備C57BL/6小鼠，4%水合氯醛深度麻醉后，4%多聚甲醛固定，取腦組織，經30%蔗糖水脫水進行冰凍切片，厚度40 μm。免疫熒光染色：取VTA腦區(qū)的腦片經封閉液封閉后，加入稀釋后的一抗(兔抗BDNF 1 ∶200，鼠抗TH 1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入二抗混合液(ALexa fluor 488山羊抗兔熒光二抗1 ∶400、ALexa fluor 546驢抗鼠熒光二抗1 ∶400)室溫避光孵育4 h，抗猝滅封片劑封片，最后用共聚焦觀察并拍照。

1.2.10RNA提取、cDNA合成及Q-PCR 按照總RNA提取試劑盒說明書提取VTA總RNA，然后利用RNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，最后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行Q-PCR檢測相關基因表達水平。反應體系及計算基因相對表達量方法參考文獻[11]。

2 結果

2.1 CUS后小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為小鼠進行21 d的CUS后，通過糖水偏好實驗，強迫游泳實驗檢測CUS后小鼠的表型，測試示意圖見圖1A。結果顯示CUS組糖水偏好降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.336，P<0.05)，見圖1B。強迫游泳結果顯示CUS組小鼠不動時間長于Control組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.273，P<0.05)，見圖1C。小鼠自主活動結果顯示CUS組小鼠與Control組小鼠比較，差異無統(tǒng)計學意義，見圖1D、E。Shapiro-Wilk檢驗各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。

圖1 小鼠抑郁樣行為測試

2.2 CUS損害小鼠的性行為上述結果已經證實CUS后小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為，接下來進一步通過小鼠嗅覺偏好測試實驗和雌鼠尿液嗅實驗檢測抑郁小鼠的性行為表現(xiàn)，小鼠嗅覺偏好測試示意圖見圖2A。結果顯示，Control組小鼠在雌鼠墊料一側的時間和在雄鼠墊料一側的時間差異有統(tǒng)計學意義(t=1.801，P<0.05)；而CUS組小鼠在雌鼠墊料一側的時間和在雄鼠墊料一側的時間無統(tǒng)計學差異(t=0.618，P>0.05)，見圖2B、C。Control組小鼠與雌鼠墊料交互的時間和與雄鼠墊料交互的時間差異有統(tǒng)計學意義(t=2.996，P<0.05)；而CUS組小鼠與雌鼠墊料交互的時間和與雄鼠墊料交互的時間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.643，P>0.05)，見圖2D。雌鼠尿液嗅實驗結果顯示Control組小鼠和CUS組小鼠聞嗅沾有水的棉簽的時間無差異，CUS組小鼠對雌鼠尿液聞嗅的時間減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.579，P<0.05)，見圖2E；每只小鼠聞嗅沾有水的棉簽的時間和沾有雌鼠尿液的時間，Control組中2只小鼠不動，CUS組1只小鼠不動，需要排除，見圖2F。

圖2 CUS后小鼠性行為測試

2.3 CUS后小鼠VTA腦區(qū)BDNF的表達下降對C57小鼠進行免疫組化測定VTA腦區(qū)BDNF與神經元的共標情況。BDNF為綠色熒光，TH為紅色熒光，BDNF和TH兩種蛋白重合之后呈現(xiàn)黃色，見圖3，結果表明VTA腦區(qū)BDNF基本存在于TH神經元中。

圖3 VTA腦區(qū)BDNF和TH免疫熒光雙標結果

行為測定結束后，取小鼠VTA腦區(qū)組織測定BDNF蛋白和mRNA的表達，結果顯示，與Control組比較，CUS組BDNF蛋白表達量降低，見圖4A，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果差異有統(tǒng)計學意義(t=9.387，P<0.05)，見圖4B。BDNF總mRNA及Exons mRNA表達量結果顯示，與Control組比較，CUS小鼠VTA腦區(qū)BDNF總mRNA表達量下降(t=4.652，P<0.05)，見圖4C；CUS組BDNF Exon Ⅰ mRNA表達量下降(t=4.557，P<0.05)，見圖4D；Exon Ⅱ mRNA表達量下降(t=3.092，P<0.05)，見圖4E；Exon Ⅳ mRNA表達量無變化(t=0.919，P>0.05)，見圖4F；Exon Ⅵ mRNA表達量無變化(t=0.114，P>0.05)，見圖4G。Shapiro-Wilk檢驗各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。

圖4 CUS組和Control組VTA腦區(qū)BDNF蛋白表達和mRNA表達水平

3 討論

性行為在哺乳動物和其他物種的繁殖中發(fā)揮重要的作用。性愛過程分為兩個階段，欲望階段和完成階段。欲望階段對于動物選擇一個合適的配偶至關重要。性愛行為的兩個階段都需要動物的感官參與。嚙齒類動物利用他們的嗅覺來控制性愛行為[1]。本研究中通過對雄性小鼠性行為相關的嗅覺行為的測試，檢測CUS致小鼠抑郁對小鼠性行為的影響。雌鼠尿液嗅實驗和小鼠嗅覺偏好測試實驗是性愛過程第一階段欲望階段的檢測，發(fā)現(xiàn)CUS致小鼠抑郁后，小鼠的性行為受損。性行為相關的神經肽和神經遞質在多個腦區(qū)調控性行為，如VTA、伏隔核(NAc)、前額葉皮層(mPFC)等。VTA腦區(qū)是調控性獎賞行為的主要腦區(qū)。多巴胺是一種受壓力應激很大的神經遞質，它與感覺運動功能、激勵動機、獎賞進程、強化學習等相關[13]。多巴胺神經元在獎賞的識別和與獎賞相關的動機行為中發(fā)揮著關鍵的作用。VTA-多巴胺環(huán)路系統(tǒng)處理情感、動機以及與社會獎賞相關的更多的認知方面的需求。研究[4]發(fā)現(xiàn)在性行為活動的獎賞屬性中多巴胺能神經元被激活。慢性應激降低VTA-多巴胺環(huán)路的活性，從而導致神經元的退化或局部小膠質細胞的激活[8]。

BDNF是大腦中含量最豐富、分布最廣的一種神經營養(yǎng)因子，不僅在早期發(fā)育中，而且在成年大腦中都被認為是神經元突觸可塑性、存活和分化的主要調節(jié)因子[5]。研究[6]報道BDNF在前額葉皮層、海馬、VTA及NAc的抑郁癥的發(fā)生發(fā)展和抗抑郁治療中起重要作用。早期的社會行為能夠調控BDNF水平和BDNF甲基化[14]。文獻[7-8]報道BDNF調控社交行為。在雌鼠特異的社交行為中，BDNF在OXY神經元中調控基因轉錄和重塑[15]。性行為影響VTA腦區(qū)BDNF的表達[10]。BDNF能夠調控動機行為并影響性行為[7-9]，應激會影響VTA-多巴胺的重塑和連接性[4]。CUS行為是一種具有預測效果、表面效度、結構效度的抑郁動物模型。本研究證實CUS所致抑郁小鼠性行為受損，VTA腦區(qū)BDNF與標記多巴胺神經元的TH共存，且VTA腦區(qū)BDNF蛋白表達和mRNA表達減少，說明VTA腦區(qū)BDNF的表達參與了性行為的調節(jié)。在后續(xù)的研究中會利用BDNF轉基因小鼠及DAT-cre轉基因小鼠進一步研究VTA腦區(qū)多巴胺神經元中BDNF敲除對小鼠性行為的影響。

綜上所述，本研究證實CUS所致的抑郁小鼠性行為受損，并且CUS能降低VTA腦區(qū)BDNF的表達。提示VTA腦區(qū)BDNF參與性行為的調控，但其發(fā)揮作用的機制還需進一步的研究。