自交聯共軛亞油酸囊泡基熒光納米點的構筑及其熒光特性

樊曄，曹崇梅，方云，夏詠梅

江南大學化學與材料工程學院，合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

1 引言

碳點(CDs)一般指尺寸小于10 nm或在其左右、具有準球形結構且能穩定發光的納米碳，自2004年面世以來1，便因其具有熒光納米點(fluorescent nanodots，以下簡稱FNDs)的性質而受到廣泛關注。這是因為CDs不僅保留了碳基材料低毒性和生物相容性等特性，而且熒光可調性強、水分散性好、抗光漂性強以及表面易于功能化，因此在分析檢測、細胞成像、藥物傳輸、發光器件、光電催化、生物傳感和癌癥治療等領域都顯示應用前景2,3。采用自上而下法制備CDs是將宏觀碳源如石墨、碳納米管和炭黑等通過激光燒灼4、電化學法5及酸蒸汽切割6等方式裂解；自下而上法常以生物質小分子如蔗糖7、檸檬酸8和氨基酸9等為碳源，也用合成小分子10,11，經過脫水、縮聚和碳化等反應制備。若以天然大分子如蠶砂12、蘋果13和紅茶14等為碳源時則需要經過先自上而下(高溫裂解)后自下而上(脫水、縮聚和碳化)的過程。此外，還出現利用小分子15或聚合物16適度交聯制備的具有獨特類聚合物碳氫鏈結構的CDs (聚合物點，PDs)，進一步豐富了CDs的結構，使其碳核結構不再局限于sp2雜化的石墨烯碎片、sp2和sp3雜化碳構成的碳納米點3。雖然生物質碳源制備碳基FNDs的方法具有原料綠色化的優勢，但是其過程的綠色化和可持續性受到質疑17，即因其化學反應的可控性差而導致原子經濟性差和FNDs產率低7,18；還會因水/溶劑熱條件而提高對設備的要求和帶來安全問題；有些甚至需消耗大量酸堿、強氧化劑或有機溶劑等，因此增加后處理過程并使廢棄物嚴重8,13。

本實驗室前期用天然來源和生理有益的共軛亞油酸(CLA)自組裝不飽和脂肪酸囊泡(ufasomes)，獲得平均粒徑在10-20 nm范圍的納米中空顆粒，并發現其本身或自交聯體在藥物緩釋、鈣離子響應性、提高耐酸性和冷水溶解度等方面顯示應用潛能19-24。本文設想，如果進一步減少對上述自交聯過程的干擾使其粒徑更均一，以及提高自交聯度使其更穩定，也許能構思一種生物質碳源經非傳統(裂解-脫水-縮聚-碳化)途徑“構筑”而非“合成”碳基FNDs的新策略，從而克服文獻中各項缺陷，使生物質碳源法更趨向于生物和環境友好、有序和可控的綠色化學過程。文獻中曾有零星報道在油酸和水不相溶體系中以乙酸碳源制備碳基FNDs25或以油酸為溶劑而蔗糖碳源制備碳基FNDs7，但鮮有用脂肪酸碳源制備碳基FNDs的報道。因此，本文將利用CLA的自組裝活性獲得分子有序排列的ufasomes，再引發其共軛雙鍵聚合獲得自交聯的ufasomes(SCU)，從而用生物質小分子CLA為碳源經自組裝-自交聯全新策略直接制備自交聯不飽和脂肪酸囊泡基FNDs(SCUFNDs)，并進一步考察該FNDs獨特的表面羧酸基團和內部自交聯度對其熒光特性的影響。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

CLA (純度≥ 95%)，購自大連醫諾生物有限公司；過硫酸銨(APS，AR)，購于國藥集團化學試劑有限公司，重結晶3次后使用；其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑公司。實驗用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)，美國Millipore Synergy UV超純水系統。

JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司，加速電壓120 kV)；FS5熒光光譜儀(英國Edinburgh Instruments公司)；TU-1950雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；ALV/DLS/SLS-5022F型激光光散射系統(德國Hosic有限公司)，PLUS-85冷凍干燥機(西班牙LYOQUEST公司)。

2.2 SCU的制備

配制氫氧化鈉的無水乙醇溶液，在磁力攪拌下將其緩緩加入等摩爾量的CLA的乙醇溶液中，經皂化得到共軛亞油酸鈉(SCL)，脫除溶劑后經真空烘箱干燥備用。用pH 8.6的硼酸(0.1 mol·L-1)-硼砂(0.025 mol·L-1)緩沖液準確配制3 mmol·L-1的SCL溶液，并取其10 mL于25 mL圓底燒瓶中，加入20 μL的APS水溶液(0.22 mol·L-1)，通氮氣30 min排除氧氣，然后將其置于80 °C的油浴中攪拌自交聯10 h得到澄清透明無任何沉淀物的SCU溶液。以下光學性質實驗中如無注明均直接使用該溶液作為SCU-FNDs溶液。

2.3 透射電子顯微鏡表征

用移液槍取10 μL的SCU-FNDs溶液滴于銅網(T10023，北京新興百瑞技術有限公司)上，用濾紙吸干多余的液體，重復三次，自然干燥后進行透射電子顯微鏡(TEM)表征。

2.4 動態激光光散射表征

SCU-FNDs溶液經Millipore Millex-HV針筒式過濾器(水相，PVDF材質)過濾至樣品瓶中，在波長632.8 nm，散射角90°，掃描時間300 s，25 °C下進行動態激光光散射(DLS)掃描，獲得光散射強度數據并計算其相應的粒子半徑(Rh)及平均粒徑(Dˉ).

2.5 自交聯度測定

SCU-FNDs溶液用pH 8.6的硼酸-硼砂緩沖液稀釋至0.06 mmol·L-1后測定其紫外吸收光譜(UV)，根據CLA在234 nm處的吸光度(A)與濃度(c，mmol·L-1)之間的紫外吸收標準曲線(A= 25.351c-0.0009，R2= 0.9998)，判斷SCU-FNDs中CLA分子的共軛雙鍵自交聯度DSC (DSC = (c0-c)/c0，c0為溶液初始濃度(mmol·L-1))。

2.6 FNDs產率測定

用超純水準確配制3 mmol·L-1的SCL溶液，取50 mL于100 mL圓底燒瓶中，加入100 μL的APS水溶液(0.22 mol·L-1)，用HCl調節至pH 8.6，通氮氣30 min排除氧氣，然后將其置于80 °C的油浴中攪拌下自交聯10 h得到澄清透明無任何沉淀物的SCU-FNDs溶液。用NaOH溶液調節至pH 8.6后用截留分子量3500的透析袋透析6 h，每隔2 h換一次透析液(超純水)，凍干后計算FNDs產率y(y=w/w0，w為FNDs生成量即透析殘留物量(mg)，w0為生物質碳源SCL的投料量(mg))。

2.7 光學性質測定

(1)光學吸收性質：將不同自交聯度的SCUFNDs溶液用pH 8.6的硼酸-硼砂緩沖液稀釋至0.06 mmol·L-1，測定其UV吸收光譜。

(2)熒光發射性質：在選定的激發波長下(如無特殊說明均為320 nm)測試各種SCU-FNDs溶液的熒光發射光譜。

(3)溫度響應性：將SCU-FNDs溶液置于不同溫度(25-85 °C范圍內每間隔10 °C)下恒溫30 min，測其熒光發射光譜，觀察其溫度響應性；循環升/降溫實驗過程同上。

(4)光漂白性：將SCU-FNDs溶液置于激發波長為320 nm的氙燈下照射60 min，每隔2 min采集一次熒光發射光譜，選取最大發射波長處的熒光強度繪制時間進程圖，觀察強化輻照條件下SCUFNDs的光漂白性；同時將SCU-FNDs溶液置于自然光下30 d，每隔3 d采集一次熒光發射光譜，選取最大發射波長處的熒光強度繪制時間進程圖，觀察自然光輻照下SCU-FNDs的長期光漂白性。

(5)耐鹽性：將SCU-FNDs配制成系列NaCl濃度(0.1-1.0 mol·L-1)的溶液，測定其熒光發射光譜，選取最大發射波長處的熒光強度繪制鹽度依賴性圖，觀察SCU-FNDs的耐鹽性。

2.8 SCU-FNDs表面的氯金酸原位還原

在10個小玻璃瓶中分別加入5 mL的SCUFNDs溶液，避光條件下置于60 °C水浴中恒溫30 min，迅速加入56 μL氯金酸溶液(10 mmol·L-1)并搖晃混勻后立即置于60 °C水浴中分別反應不同時段，反應完成后立即轉移至冰箱(-18 °C)中冷卻10 min終止反應，取出樣品測定熒光發射光譜。

3 結果與討論

3.1 SCU-FNDs的制備與表征

由于紫外輻照聚合引發劑如異丙基硫雜蒽酮(ITX)等自身具有熒光，會干擾后續考察SCU作為FNDs的熒光行為，而熱聚合引發劑如APS等自身沒有熒光，因此本文采用熱聚合的方式獲得SCU20。圖1和圖2用TEM、DLS和234 nm處的吸光度綜合表征了SCU的自組裝形貌、粒徑分布和自交聯度。圖1a為SCU的TEM圖，表明其具有中空形貌，符合脂肪酸在其pKa附近易于形成囊泡的特征22,24；圖1b顯示其平均粒徑為17 nm左右；圖1c中通過DLS獲得的統計粒徑為17.5 nm，與TEM的結果相吻合，該粒徑適合FNDs的范圍但該法不易得到粒徑小于10 nm的FNDs；根據圖2中SCU在234 nm處的吸光度計算得CLA的自交聯度約為75%，其形貌能耐受電子轟擊和pH變化21,22，因此足以使SCU顆粒穩定作為FNDs。圖2插圖中紫外光譜細節顯示SCU在270 nm處有少許吸收，與CDs的π-π*躍遷相似26,27，歸因于交聯后產生了類似苯環的大π鍵；圖2還顯示在320 nm最佳激發波長下SCU的最大熒光發射為400 nm，插圖照片表明其在365 nm紫外燈下呈藍綠熒光，具有FNDs的熒光性質。另外，CLA碳源經自組裝-自交聯策略制備SCU-FNDs的原料利用率很高，反應液清澈透明無固廢排放，不僅環境友好而且透析后FNDs產率仍高達73.9%。

圖1 CLA的SCU的表征：(a)TEM圖，(b)粒徑分布圖和(c)DLS圖Fig. 1 Characterization of the SCU of CLA by (a)TEM and (b)the resultant size distribution, and (c)DLS.

圖2 CLA的ufasomes和SCU的紫外、熒光激發(EX)和發射光譜(EM)(左插圖為紫外光譜局部放大圖，右為SCU在365 nm紫外燈下的照片)Fig. 2 UV absorption, fluorescence excitation (EX)and emission (EM)spectra of the ufasomes and the resultant SCU of CLA (The insets are close-up views of the UV spectra left and a photo of the SCU under 365 nm UV lamp right).

3.2 表面羧基對SCU-FNDs的熒光特性的影響

研究發現改變電化學蝕刻碳纖維的條件可以得到表面含氧量不同的CDs，其熒光特性受表面含氧量影響28；Ding等29通過色譜柱分離出不同發光特性的CDs，發現發光特性同樣受CDs表面的含氧基團含量控制。自組裝和自交聯策略使得該法獲得的碳基FNDs具有明確的分層結構，表面為CLA的羧基所覆蓋，而內部由部分聚合的CLA的碳氫鏈有序但交聯狀排列。鑒于SCU-FNDs的內外分層結構特性，本文首先特別關注其富集羧基的特有表面結構對熒光性質的影響。在SCU-FNDs中加入氯金酸，利用羧酸的弱還原性19減少表面羧基含量，觀察其對熒光強度的影響。圖3a為不同還原時間下SCU-FNDs的熒光發射光譜，其最大峰值的時間進程如圖3b所示。可以看出加入氯金酸反應5 min后SCU-FNDs熒光強度迅速降低，隨反應時間延長而變緩并趨于穩定，這應該是還原反應減弱并終止所致。該結果表明SCU-FNDs的表面羧基含量與熒光強度有正相關性，啟示我們可以進一步對SCU-FNDs進行表面元素摻雜改性，以獲得不同熒光強度和熒光發射波長的改性SCU-FNDs，或探索用于各種金屬離子檢測和多功能傳感材料12。

圖3 HAuCl4還原SCU-FNDs的熒光發射光譜(a)及其最大峰值的時間進程圖(b)Fig.3 Fluorescence spectra of the SCU-FNDs after reduction of HAuCl4 (a)and the relevant time course of the maximum fluorescence intensity (b)

3.3 自交聯程度對SCU-FNDs的熒光特性的影響

研究發現某些具有π-共軛結構的分子的聚集行為可以限制分子內旋轉(RIR)從而產生聚集誘導發光(AIE)現象30；而一些非π-共軛結構的聚合物在溶劑中的聚集體會產生熒光發射31,32；還發現非π-共軛結構的聚合物也可以通過適度交聯增強PDs的熒光強度33,34；由于缺少相關數據，還未見研究碳骨架結構(如石墨烯或碳納米管或碳黑)及剛性對CDs熒光特性的影響。

本文由CLA自組裝得到的ufasomes中分子間氫鍵作用和疏水作用均會增強對囊泡壁層中CLA分子的限域作用從而導致AIE現象，圖4a中ufasomes在365 nm紫外燈下有藍色乳光證明了這一點，但不能排除乳濁度對體系熒光現象的影響。而圖4a中SCU-FNDs在日光下為無色透明狀，在365 nm紫外燈下發出明亮的藍光，則歸因于自交聯過程通過共價鍵交聯進一步增強限域作用或SCU的剛性，因而產生了類似于CDs的強熒光發射。為了排除圖4a中乳濁度對ufasomes體系熒光現象的影響，在CLA可以大量形成ufasomes的pH區間(8.6 ± 1.0)精細調節pH值并測定其熒光發射光譜，由圖4b可見以pH 9.0分界，低于9.0的體系出現一個尖刺的熒光發射峰，與插圖上排照片中低于9.0的體系出現乳光相互印證，而下排照片在365 nm紫外燈下均發出微弱藍光。因此如圖4c所示，ufasomes有且僅有微弱熒光，其在較低pH值下突增的尖刺狀發射峰系乳光增強的假象；而SCU體系在兩種pH值下均呈現穩定的強熒光發射，因此認為是共價交聯增強熒光發射(CEE效應)34。

圖4 Ufasomes和SCU-FNDs的熒光性質比較：(a)pH 8.6下的光照照片；(b)不同pH下ufasomes的熒光光譜圖(上方插圖為日光下，下方為365 nm紫外燈下的照片)；(c)不同pH下ufasomes和SCU-FNDs的熒光光譜圖Fig. 4 Comparison of fluorescence properties between the ufasomes and the SCU-FNDs: (a)Photos taken under different light resources at pH 8.6; (b)Fluorescence spectra of the ufasomes at different pH (the upper inserted photos in sunlight, and the bottom photos under 365 nm of UV lamp); (c)Comparison of fluorescence spectra of the ufasomes and the SCU-FNDs at different pH.

鑒于SCU-FNDs的內外分層結構特性，本文同時特別關注ufasomes經自交聯后的有序碳氫鏈特有內部結構對其熒光強度的影響。圖5a通過加大引發劑用量增大SCU-FNDs的自交聯度，圖5b，c發現熒光強度及最大峰值隨引發劑用量增大而增大。這應該是自交聯過程借助共價鍵增多而增強了SCU-FNDs的碳氫鏈骨架的剛性，進一步限制分子的振動弛豫，使得體系的非輻射躍遷減弱且輻射躍遷增強，從而產生了更強的熒光發射16,34。這一結果不僅對進一步改善SCU-FNDs類自組裝FNDs的碳氫鏈骨架結構，從而改善其熒光特性有指導意義，而且可供探討石墨烯或碳納米管或碳黑等碳骨架剛性對CDs熒光特性的影響時參考。

上述實驗結果表明，ufasomes結構對其中CLA分子的限域作用以及SCU借助共價鍵交聯提高顆粒剛性均可以使具有碳氫鏈骨架的SCU-FNDs像普通碳骨架的CDs一樣發光，這些作用對CDs熒光強度的影響按下述順序降低：碳骨架＞碳氫鏈共價交聯(CEE效應)＞＞碳氫鏈限域(AIE效應)；還表明SCU-FNDs的熒光特性隨其表面羧基含量和自交聯度的變化而變化。

圖5 pH 8.6下引發劑量對SCU-FNDs的DSC及熒光性質的影響：(a)紫外圖譜；(b)熒光圖譜；(c)熒光強度與DSC關系Fig. 5 Influence of the dosages of initiator on DSC and fluorescence properties of the SCU-FNDs: (a)UV spectra;(b)Fluorescence spectra; (c)Relationships between fluorescence intensities and the DSC values.

3.4 SCU-FNDs的溫敏性熒光特性

碳核態或非摻雜CDs一般不易具備溫敏性熒光特性，然而我們預期自交聯雖然使SCU-FNDs具有了一定的剛性，但其內部的長碳氫鏈仍保留了一定的鏈運動自由度，溫度升高可能會加劇鏈運動使SCU-FNDs的剛性下降，從而導致熒光強度降低，并產生與摻雜CDs類似的溫敏性熒光特性12。因此本文將進一步探究SCU-FNDs的熒光強度隨溫度變化的響應性。在圖6a，b完成的一次25-85 °C間升/降溫循環中，圖6a表明SCU-FNDs的熒光強度隨升溫而不斷降低至起始值的60.5%，圖6b則顯示了相反的降溫規律；圖6c表明單次升/降溫循環中各個溫度下的最大熒光強度均滿足共同的線性回歸方程：I/I0= -0.00977T+ 1.229 (T：25-85 °C，R2= 0.99)；圖6d顯示25-85 °C間進行多次升/降溫循環獲得的25和85 °C下的最大熒光強度各自基本相同(RSD值較小)。圖6的實驗結果共同說明SCUFNDs的熒光強度具有極好的溫敏性以及單次/多次升降溫循環的重現性，無需像摻雜CDs那樣依賴其它外加元素提供明顯的溫敏性，因此在綠色安全溫敏性碳基FNDs熒光探針方面顯示應用潛能。

圖6 SCU-FNDs的溫敏性熒光特性：(a)升溫過程和(b)降溫過程的熒光光譜圖；(c)一次升/降溫循環中最大熒光強度-溫度的線性回歸；(d)多次升降溫循環中25和85 °C相應的最大熒光強度重現性Fig. 6 Temperature-sensitive fluorescence characteristics of the SCU-FNDs: (a)Heating and (b)cooling fluorescence spectra; (c)Linear regression of the maximum fluorescence intensities and temperatures in one temperature cycle;(d)Reproducibility of the maximum fluorescence intensities respectively corresponding to 25 and 85 °C in multiple temperature cycles.

SCU-FNDs的形成機制如示意圖1所示，說明本文以小分子生物質CLA為碳源，經過自組裝和自交聯策略而非傳統(裂解-脫水-縮聚-碳化)途徑，成功制得了顆粒穩定且粒徑均一，具有藍綠熒光發射特性的SCU-FNDs；該方法具有不用有機溶劑、酸堿和氧化劑，無需純化過程以及無固廢物，且FNDs產率高達70%以上等優點；因而使碳基FNDs制備更滿足生物和環境友好、有序和可控的綠色化學過程的要求。

示意圖1 自組裝和自交聯策略從CLA分子構筑溫敏性SCU-FNDs的機理Scheme 1 Mechanism illustration for self-assembly and self-crosslink strategy to fabricate the temperature-sensitive SCU-FNDs from CLA molecules.

3.5 SCU-FNDs的光漂白性和耐鹽性

將SCU-FNDs在激發波長為320 nm的氙燈下持續照射，每隔2 min測定一次熒光發射光譜，觀察輻照時長對其熒光性質的影響即光漂白性。圖7a的實驗結果表明熒光強度隨時長增加先略有降低(小于10%)后趨于平緩，熒光強度并無顯著變化說明SCU-FNDs在強化輻照下具有良好的抗光漂白性；圖7b表明在自然光照30 d周期內每隔3 d測定一次，熒光強度并無顯著變化說明其長期抗光漂白性好。SCU-FNDs具有與文獻報道的傳統CDs相似的良好抗光漂白性并優于傳統染料35，因此可長期保存使用。圖7c中SCU-FNDs溶液的熒光強度在不同氯化鈉濃度下均維持不變，說明SCU-FNDs具有良好的耐鹽性，可在生理鹽水環境中應用。

圖7 SCU-FNDs的熒光穩定性：(a)短期(氙燈)和(b)長期(自然光)光漂白性；(c)耐鹽性(a1-c1)為熒光發射光譜；(a2-c2)為最大熒光強度Fig. 7 Stability of fluorescence properties of the SCU-FNDs for photobleaching under light radiation by(a)xenon lamp (short term)and (b)natural light (long term); (c)NaCl tolerance (a1-c1)is the fluorescence emission spectra; (a2-c2)is the maximum fluorescence intensity.

4 結論

本文以生物質小分子CLA為碳源，利用其表面活性和聚合活性在pH 8.6時通過自組裝和熱交聯得到顆粒穩定且粒徑均一(17 nm)，具有藍綠熒光發射的SCU-FNDs，開發了一條生物質碳源經非傳統(裂解-脫水-縮聚-碳化)途徑制備熒光FNDs的新途徑。與其它用生物質原料制備CDs的報道相比，該過程具備以下生物和環境友好、有序和可控的綠色化學特征：以常溫水相小分子有序自組裝控制FNDs的粒徑，故條件溫和且低能耗，粒徑可控性強；除加入APS外未引入任何有毒有害的試劑或溶劑，故生物相容性好；以共軛雙鍵自交聯反應為主，不包含裂解、脫水、縮聚或碳化等機理不明或不可控反應，故反應可控性和產物可控性強，原料利用率高及FNDs產率高達73.9%，故有利于大規模制備；無需分離純化即可應用且無固廢物排放，故環境友好。熒光性能實驗結果顯示SCUFNDs的最大激發波長為320 nm，其熒光強度隨囊泡表面羧酸基團減少而減弱，隨自交聯度增大而增大，表明SCU-FNDs的熒光特性隨其表面羧基含量和自交聯度變化而變化，因而熒光特性具有可調性；同時獨特的自組裝-自交聯結構使其熒光強度具有良好的溫度線性響應性，符合I/I0= -0.00977T+1.229 (T= 25-85 °C，R2= 0.99)，因而在制備無摻雜的綠色安全碳基FNDs用作溫敏性熒光探針等方面具有應用潛力；另外SCU-FNDs具有的中空結構還使其可能兼具熒光探針和藥物傳輸系統(DDS)的雙重功能。