IL-10在青光眼引流物材料植入術后瘢痕組織中的動態表達

張康玉，蔣正軒，陶黎明，鮑 寧，李 凱，劉 勇

0引言

青光眼是一類以眼內壓的相對或絕對升高引起視神經損害及視功能不可逆損傷為特征的眼科常見疾病，以發病率高、病情復雜、術后并發癥較多及手術成功率較低為主要特點[1]。而難治性青光眼是一組病因多樣、病情復雜、治療棘手的疾病，青光眼引流物最初的引入即是為治療難治性青光眼，目前該方法仍是難治性青光眼主要的治療手段[2]，然而手術成功率仍相對較低，青光眼引流閥植入術后早期和晚期成功率分別約80%和50%[3]，其主要原因為術后閥體周圍嚴重的炎癥及免疫反應，成纖維細胞和膠原纖維增生包裹，致引流不暢，眼內壓再次升高[4]。術后炎癥反應在術后瘢痕形成過程中起到重要作用，而相關研究顯示白細胞介素(IL)類炎癥因子在術后炎癥細胞浸潤、組織損傷及修復過程中發揮著重要作用[5]。已有研究顯示IL-10不僅具有炎癥抑制和免疫調節作用[6-7]，亦具有抑制矽肺、炎性腸道疾病及肝纖維化的作用[8-10]，而在青光眼引流物植入術后纖維化過程中的作用研究較少。因此本研究通過不同的引流物材料植入及抗纖維化藥物的應用，擬在球結膜下形成不同的瘢痕組織，檢測并比較術后各組織中不同時間段IL-10的表達水平，揭示其對青光眼引流物植入術后炎癥及纖維化的影響，為探討其在青光眼引流物植入術后瘢痕化的作用提供實驗依據。

1材料和方法

1.1材料購置標準新西蘭大白兔75只(約2.5kg)并飼養于安徽醫科大學動物實驗室。表面涂裹聚一氯對二苯(Parylene C)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料由美國加州大學提供，絲裂霉素C(MMC)、硅膠塊由安徽醫科大學第二附屬醫院提供。主要試劑：ELISA試劑盒(Elabscience公司)，RNA提取試劑盒(Magen公司、R4130-03)，逆轉錄試劑(Vazyme公司、R222-01)，實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(Vazyme公司、SYBR Green Master Mix)，兔抗兔IL-10多克隆抗體(北京Bioss，bs-0698R)，辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(北京中杉金橋公司，ZB-2301)。主要儀器設備：光學顯微鏡、石蠟切片機、RT-PCR儀(Aglient Technologies公司、型號：Stratagen Mx3000P)、分光光度計(Thermo公司、型號：NANODROP 2000c)、逆轉錄儀(MJ Research公司、型號：PTC-100)、酶標儀(Cloud-Clone公司、型號：SMR16.1)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)[11]。本研究經安徽醫科大學生物醫學倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及造模采用隨機數字表法將75只新西蘭大白兔分為3組、每組25只：PMMA組、硅膠-MMC組及硅膠組。選擇左眼為手術眼，術前3d術眼點抗生素眼液，每天4次，預防感染。術前行全身麻醉(戊巴比妥鈉注射液耳緣靜脈給藥、40mg/kg)，縫線懸吊開瞼，聚維酮碘沖洗結膜囊，以穹窿為基底部作球結膜瓣，向上充分分離并植入5mm×5mm引流物材料塊(PMMA組在球結膜下植入聚一氯對二苯涂層包裹的PMMA塊；硅膠-MMC組于球結膜下植入硅膠塊，同時注射0.4mg/mL的絲裂霉素C 1mL；硅膠組于球結膜下植入硅膠塊)，間斷縫合球結膜瓣，結膜囊涂左氧氟沙星眼膏。分別于術后第1、3d，1、2、3、4、8wk，全身麻醉下取前房水；于第1、2、3、4、8wk，過量麻醉致死后取出植入物周邊結締組織(包括部分黏連鞏膜)，切割均分、稱重、清洗(9%氯化鈉注射液)，分別置于冰箱(-80℃)和多聚甲醛溶液(10%)中保存。

1.2.2ELISA檢測房水中IL-10蛋白的含量收集兔前房水，采用ELISA試劑盒檢測房水中IL-10蛋白的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。酶標儀測定吸光度(A)值，分別繪制三組蛋白標準曲線，計算相對質量濃度。為了確保結果的可靠性，每個樣本均進行3次檢測后取平均值。

1.2.3RT-PCR檢測結締組織中IL-10mRNA相對表達量根據RNA提取、逆轉錄及SYBR Green Master Mix試劑盒操作說明，首先提取總RNA，測定其質量及濃度，再合成cDNA，熒光定量測定。為確保測定結果的可靠性，在熒光定量測定過程中，對每個樣本均進行3次檢測后取平均值，采用2-ΔΔCt(ΔCt=sample-control)法計算IL-10 mRNA相對表達量。RT-PCR引物由通用生物公司在線設計及合成。內參GAPDH前引物：AGCTGGTCATCAACGGGAAG，后引物：GGTTCACGCCCATCACAAAC；IL-10前引物：GAACCACAGTCCAGCCATCA，后引物：CTCCACTGCCTTGCTCTTGTT。

1.2.4石蠟切片的制備將多聚甲醛溶液固定的組織經梯度乙醇充分脫水，二甲苯及無水乙醇透明，浸蠟包埋，連續切片(厚度5μm)，載玻標記、烘干保存。

1.2.5HE染色法取1.2.4石蠟切片，復溫，二甲苯、乙醇浸泡脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，封片保存。高倍顯微鏡(400×)下觀察切片組織、拍攝照片、計數成纖維細胞數。

1.2.6免疫組織化學染色取1.2.4石蠟切片，常規脫蠟、高壓修復抗原，加對應一抗、生物素化二抗、鏈霉素工作液，顯色并封片保存。高倍顯微鏡(400×)下觀察并拍照。以組織中出現棕褐色染色為陽性。通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統采集、分析處理圖像，計數平均吸光度(A)值，測定3個視野，取平均值。

2結果

2.1HE染色觀察成纖維細胞增生和炎癥細胞浸潤情況高倍鏡(400×)下觀察術后成纖維細胞增生明顯的結締組織(圖1)。第1wk，硅膠-MMC組、PMMA組和硅膠組組織中均存在細胞核增大、深染、分裂相增多、炎癥細胞浸潤的現象，但硅膠組較其他兩組更顯著。第2wk，各組組織中炎癥細胞浸潤均較第1wk時減輕，成纖維細胞增生，硅膠組炎癥細胞最多，硅膠-MMC組炎癥細胞最少。與第2wk相比，第3wk各組組織中成纖維細胞增多，炎癥細胞明顯減少，其中硅膠組仍然最多，硅膠-MMC組最少。與第3wk相比，第4wk各組組織中成纖維細胞明顯增多，膠原纖維增生，而炎癥細胞明顯減少，硅膠組較PMMA組及硅膠-MMC組可見更為紊亂的成纖維細胞、密集交錯分布的膠原纖維，仍伴有明顯炎癥細胞浸潤，硅膠-MMC組仍為最少。第8wk，各組組織中均可見較致密的膠原纖維交錯呈旋渦狀或波紋狀等多樣性紊亂排列，硅膠組仍有少量炎癥細胞浸潤，其他兩組無明顯炎癥細胞。

圖1 HE染色觀察成纖維細胞增生和炎癥細胞浸潤情況 藍色箭頭：炎癥細胞；紅色箭頭：成纖維細胞。

2.2免疫組織化學染色觀察IL-10蛋白表達情況高倍鏡(400×)下觀察可見術后PMMA組、硅膠-MMC組和硅膠組結締組織中均存在大量的呈棕褐色染色的IL-10蛋白，圍繞鞏膜表面增生的成纖維細胞分布(圖2)。第1wk，IL-10在三組組織中的表達均明顯增多，硅膠組最顯著，硅膠-MMC組最少(F=19.791，P<0.001)；第2wk，IL-10在三組組織中的表達均較第1wk減少，硅膠-MMC組最少，硅膠組仍最多(F=20.047，P<0.001)；第3wk，IL-10在三組組織中的表達均較第2wk減少，硅膠組較其他兩組稍高，而PMMA組與硅膠-MMC組無明顯差異(F=7.521，P=0.008)；第4wk，IL-10在三組組織中的表達均較第3wk有所增加，硅膠組高于其他兩組，PMMA組與硅膠-MMC組亦無明顯差異(F=6.826，P=0.010)；第8wk，IL-10在三組組織中的表達較第4wk均明顯增多，增生細胞仍圍繞膠原纖維分布，硅膠組表達最多，瘢痕組織較少的硅膠-MMC組表達最少(F=12.382，P=0.001)，見圖3。

圖2 免疫組織化學染色觀察IL-10蛋白表達情況。

圖3 三組IL-10蛋白表達水平比較 aP<0.05 vs 硅膠組；cP<0.05 vs PMMA組。

2.3ELISA檢測房水中IL-10的表達術后三組房水中IL-10的表達呈現先增高再降低的趨勢，第3d達高峰。術后第1d～3wk，硅膠組房水中IL-10表達均明顯高于PMMA組與硅膠-MMC組，且術后第1～3d硅膠-MMC組房水中IL-10表達高于PMMA組；術后第1wk，PMMA組房水中IL-10表達高于硅膠-MMC組；術后第2～3wk，PMMA組與硅膠-MMC組房水中IL-10的表達無明顯差異；術后第4～8wk，三組房水中IL-10的表達均無明顯差異(F第1d=11.091，P第1d=0.002；F第3d=20.701，P第3d<0.001；F第1wk=28.039，P第1wk<0.001；F第2wk=13.818，P第2wk=0.001；F第3wk=8.141，P第3wk=0.006；F第4wk=2.208，P第4wk=0.153；F第8wk=2.759，P第8wk=0.103)，見圖4。

圖4 三組房水中IL-10的表達 aP<0.05 vs 硅膠組；cP<0.05 vs PMMA組。

2.4RT-PCR檢測結締組織中IL-10mRNA的表達術后三組結締組織中IL-10 mRNA表達均明顯增高，但硅膠組增高最明顯，與PMMA組、硅膠-MMC組比較均有差異；術后第1、2、8wk，PMMA組與硅膠-MMC組IL-10 mRNA表達亦有差異(F第1wk=17.757，P第1wk<0.001；F第2wk=26.941，P第2wk<0.001；F第3wk=6.283，P第3wk=0.014；F第4wk=14.418，P第4wk=0.001；F第8wk=41.615，P第8wk<0.001)，見圖5。

圖5 三組IL-10 mRNA相對表達量 aP<0.05 vs 硅膠組；cP<0.05 vs PMMA組。

2.5IL-10表達水平與成纖維細胞數的相關性分析術后第4、8wk，高倍顯微鏡(400×)下，單位面積HE染色切片中成纖維細胞數與免疫組織化學染色中IL-10的表達水平均呈正相關(r=0.712、0.695，均P<0.05)，見圖6。

圖6 三組組織中IL-10表達水平與成纖維細胞數的相關性分析 A：術后第4wk；B：術后第8wk。

3討論

青光眼是致視神經不可逆性損傷的眼病，以眼球脹痛、視力下降及特征性視野缺損為主要表現；高發病率[12-13]、視功能損傷不可逆性、難治性等為主要特征；控制眼內壓仍是目前主要的治療方法[3]。難治性青光眼是最復雜的一組青光眼疾病，包括外傷性青光眼、角膜移植術后繼發性青光眼、無晶狀體或人工晶狀體植入術后青光眼、新生血管性青光眼、多次手術失敗的青光眼等。青光眼引流物植入術是抗青光眼的有效治療方法，亦是難治性青光眼的首選手術方法[2]；青光眼引流物材料以硅膠、PMMA較為多見，作為異物，植入球壁后易誘發機體炎癥反應、免疫排異反應及成纖維細胞增生，導致瘢痕組織包裹植入物、引流受阻，手術失敗。因此檢測青光眼引流物植入術后瘢痕化組織中抑炎因子IL-10的表達及探討其對瘢痕化形成的影響有著極其重要的意義。

不同材料的青光眼引流物具有不同的組織相容性，植入后可引起不同的炎癥及免疫反應[14]，MMC為鏈霉素中提取的抗代謝藥物，具有抗纖維組織增生作用，在臨床已廣泛應用[15]。Parylene C是一種惰性的高分子材料，因具有良好的生物相容性及化學穩定性，涂抹于青光眼引流物外層可以有效降低術后局部組織的炎癥反應及成纖維細胞增生[11]。本研究選擇不同的材料植入兔球結膜下，再選擇性注射MMC，預計術后各組球結膜下形成不同的瘢痕。HE染色顯示，硅膠組術后早期的炎癥反應及晚期瘢痕化水平最高；因MMC藥物的刺激作用，術后早期硅膠-MMC組的炎癥反應高于PMMA組，但至術后第1wk，PMMA組炎癥因子的表達較硅膠-MMC組高，PMMA組的成纖維細胞增生及晚期瘢痕化水平亦較硅膠-MMC組高。提示本研究中各組不同時期形成不同的炎癥反應及瘢痕化組織。

IL-10是在炎癥反應中發揮抑制作用的因子，是由輔助性T2(Th2)細胞產生，具有抑制輔助性T1(Th1)細胞分泌作用，由嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞、樹突細胞、肥大細胞、NK細胞等分泌，具有抗炎、抗免疫、抗纖維化及促進修復等作用的多功能細胞因子[16-17]。IL-10的炎癥抑制作用在大量研究中得以證明，其可以抑制單核細胞、巨噬細胞，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)等促炎因子的釋放，同時誘導炎癥因子的自噬作用[18]；亦可抑制T細胞增生和其細胞因子的產生，如可以抑制CD4+細胞分化所必需的IL-23、IL-12等因子的分泌[7，19]；而且通過降低組織相容性復合體(MHC)和黏附分子的表達抑制排異反應抗原，干擾抗原傳遞，抑制免疫反應[20]。

IL-10對成纖維細胞增生及瘢痕化的作用也有大量研究，但具體作用目前尚不統一。Kathju等[21]研究顯示IL-10可以通過抑制炎癥及免疫反應，同時分解增生的細胞基質，抑制成纖維細胞增生及瘢痕形成。IL-10在塵肺的形成中具有抑制肺炎癥反應的作用，而晚期因對淋巴細胞的抑制作用，具有促進肺泡纖維化的增生作用[22]。Xie等[23]對瘢痕增生的研究發現，創傷后IL-10的高表達不僅具有抑制促炎因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)的分泌，減輕炎癥反應及抑制細胞外間質細胞增生的作用，同時可以抑制生長因子[轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長因子(PDGF)等]的釋放，維持細胞外基質合成和降解的平衡，抑制瘢痕形成。本研究顯示，IL-10 mRNA及蛋白的表達在術后早期炎癥反應明顯時增加，炎癥反應減輕時降低，在瘢痕化最明顯的硅膠組表達最高，在瘢痕化最輕的硅膠-MMC組表達最低；免疫組織化學染色結果顯示，IL-10主要集中在增生的成纖維細胞周圍；在術后第4～8wk，炎癥反應減輕而膠原纖維增生明顯時，IL-10的表達不減反增。上述結果表明抑炎因子IL-10不僅在術后早期炎癥反應嚴重時增加，抑制炎癥作用，而且在術后晚期成纖維細胞及膠原纖維增生時增加，抑制其增生作用。

綜上所述，IL-10在青光眼引流物材料植入術后早期炎癥反應明顯時表達增高，炎癥反應減輕時減少，晚期膠原纖維增生時再次升高，提示IL-10可能在青光眼引流物植入術后早期有抑制炎癥的作用，晚期有抑制膠原纖維增生，減輕瘢痕化的作用。