大豆籽粒低聚糖及其組分含量鑒定與特異種質篩選

李俊茹，秦 寧，李文龍，杜 匯，李喜煥，張彩英

(河北農業大學 / 華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北保定 071001)

0 引 言

【研究意義】大豆低聚糖是其可溶性糖含量總稱，一般包括蔗糖、棉籽糖、水蘇糖等，分別占其籽粒干基含量5%、1%和4%(合計約占8%～10%)[1-6]。大豆低聚糖具有促進營養物質吸收等多種功能[7-11]。低聚糖還可作為一種低甜度、低熱量的甜味劑替代食品加工中的蔗糖。低聚糖所具有的抗淀粉氧化功能還可用于延長食品貯藏期限。【前人研究進展】宋志峰等[12]利用高效液相色譜方法，測定來自吉林省的500份大豆品種資源低聚糖含量，結果表明，籽粒低聚糖含量分布在7.73%～13.46%，其中超過12%的品種有49個，蔗糖含量分布在3.42%～8.27%，棉籽糖含量分布在0.41%～1.37%，水蘇糖含量為3.23%～4.87%。王曉巖等[13]通過分析大豆近等基因系材料在不同生態環境條件下的低聚糖及其組分含量，發現不同環境條件下的供試大豆材料籽粒低聚糖含量存在一定差異，其中在2種環境條件下均表現較優的材料有10個。王曙明等[14]分析吉林省181份大豆資源低聚糖含量發現，低聚糖、棉籽糖和水蘇糖含量變異范圍為2.6%～6.7%、0.3%～1.8%和2.1%～5.1%；Yoshikawa等[15]研究15個納豆品種(包括3個優質、9個中等、3個劣質品種)籽粒低聚糖含量發現，優質納豆資源的低聚糖含量顯著高于其它品種；王躍強等[16]利用美國大豆V97-3000與V99-5089構建的分離群體，經測定其籽粒低聚糖含量發現，供試材料間存在較大差異。Kerr和Neus[17-18]通過測定美國大豆種質資源低聚糖含量，篩選出2份高蔗糖、低水蘇糖特異種質，其蔗糖含量分別可達9.4%和11.2%，而水蘇糖含量為0.64%和0.14%。【本研究切入點】盡管目前有少數關于吉林及國外大豆籽粒低聚糖含量測定及優異資源篩選研究報道，但篩選出的種質資源遠不能滿足育種和生產需求。需研究大豆低聚糖及組分含量遺傳變異及其相關關系。【擬解決的關鍵問題】利用336份來自于不同省份及不同類型的大豆品種資源，采用高效液相色譜技術鑒定其籽粒低聚糖及其組分含量，研究其遺傳變異及其相關關系，并遴選低聚糖及其組分含量特異種質，為大豆低聚糖含量遺傳改良奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

以336份東北生態區大豆資源為材料，包括農家品種和育成品種(系)，由中國農業科學院作物科學研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

供試材料于2019年種植于河北農業大學作物育種中心(河北保定)，行長1.5 m，行距0.5 m，隨機區組設計，2次重復。

1.2.2 低聚糖組分標準樣品配制及其線性方程

準確稱取蔗糖、棉籽糖和水蘇糖標準品各250 mg，10 mL超純水溶解，并用乙腈定容至25 mL，配制成10 g/L標準品儲備液[19]；分別從儲備液中精確移取一定數量標準溶液，置于10 mL容量瓶，定容后形成標樣；制備標準樣品進行低聚糖及其組分含量測定，制作線性方程，計算其決定系數，用于供試資源低聚糖含量測定。表1

表1 低聚糖組分線性回歸方程及其決定系數Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient of oligosaccharides

1.2.3 大豆樣品的制備

大豆低聚糖含量測定方法基本流程如下[20-24]：利用研磨機將供試大豆品種資源籽粒研磨粉碎，過60目篩；稱取0.1 g上述豆粉(精確到0.000 1 g)，加入1.5 mL乙醇(75%色譜純)溶解振蕩15 s，超聲浸提1 h(40 Hz，60℃)；于超聲浸提后4 000 r/min離心10 min，吸取上清，過0.22 μm微孔濾膜；將濾液置于樣品瓶，經液相色譜方法測定其蔗糖、棉籽糖、水蘇糖及其低聚糖含量。

選擇65∶35、70∶30、75∶25 3種組合進行單因子試驗，在其它條件一定的情況下，比較不同比例流動相條件，大豆籽粒中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖的出峰時間及理論塔板數。

1.2.4 低聚糖測定高效液相色譜基本條件

色譜柱：島津Inertsil氨基柱(規格為4.6×250 mm，5 μm)；流動相：超純水30%：乙腈70%(流動相超聲脫氣30 min)；流速：1 mL/min；檢測器：RID示差折光檢測器；色譜柱溫度：35℃；檢測器溫度：40℃；進樣量：10 μL。

1.3 數據處理

試驗數據描述統計、方差分析與聚類分析等采用SPSS21.0和Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 大豆低聚糖及組分含量測定方法建立

2.1.1 流動相的確定

研究表明，隨著流動相中乙腈比例的增加，大豆低聚糖3種組分的出峰時間延長。流動相比例在75∶25和70∶30之間都有良好的柱效(理論塔板數大于6 000)，選擇70∶30為流動相。表2

低聚糖3種組分能夠很好的分離，且峰形較好，標準品出峰時間與樣品一致，提取樣品中的成分分別是蔗糖、棉籽糖、水蘇糖。在保留時間夠短，柱效較高的情況下，選用30∶70的流動相配比。圖1，圖2

2.1.2 低聚糖檢測方法的可靠性檢驗

研究表明，同一大豆樣品連續6次技術重復測定結果之間相差較小，數值接近，其相對標準偏差分別為0.53%(蔗糖)、1.72%(棉籽糖)和1.04%(水蘇糖)，均未超出2%允許誤差；重復間的數值非常接近，相對標準偏差分別為0.76%(蔗糖)、1.24%(棉籽糖)和0.98%(水蘇糖)，也小于2%誤差標準。表3，表4

表2 流動相比例Table 2 Results of different ratio of mobile phase’s experiment

圖1 低聚糖組分標準品液相色譜圖Fig.1 The oligosaccharide chromatogram of standard samples

圖2 低聚糖組分大豆樣品液相色譜圖Fig.2 The oligosaccharide chromatogram of soybean samples

表3 大豆低聚糖組分含量測定方法的技術重復精密度Table 3 The precision analysis of soybean oligosaccharides methods on technical duplication

表4 大豆低聚糖組分含量測定方法的生物學重復精密度Table 4 The precision analysis of soybean oligosaccharides methods on biological duplication

2.2 大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量總體評價

研究表明，其籽粒蔗糖、棉籽糖、水蘇糖、低聚糖平均含量分別為4.01%、1.16%、2.60%和7.77%，3種組分以蔗糖含量最高；同時發現，其變化范圍分別為2.13%～6.26%、0.30%～2.00%、0.95%～3.87%及5.63%～11.13%，變異系數分別為15.21%、25.51%、19.16%與9.04%，以棉籽糖含量變異系數最大。有64.88%品種蔗糖含量分布在3.37%～4.47%，65.77%品種棉籽糖含量分布在0.81%～1.37%，57.44%品種水蘇糖含量分布在2.22%～3.00%，77.68%品種低聚糖含量分布在6.91%～8.38%。表5，表6

表5 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量遺傳變異Table 5 The genetic variation of oligosaccharide and its component contents in soybean varieties

表6 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量分布Table 6 The distribution of oligosaccharide and its component contents in soybean varieties

2.3 大豆籽粒低聚糖及組分間的相關性

研究表明，低聚糖含量與蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量間存在極顯著相關，并以低聚糖與蔗糖間的相關系數最高(0.721)，低聚糖與棉籽糖含量間的相關系數達0.513，蔗糖與棉籽糖間的相關系數達0.351，均達到極顯著水平，而水蘇糖與蔗糖、棉籽糖間則呈現極顯著負相關(r=-0.415；r=-0.298)，協調水蘇糖與其它組分間關系是實現大豆低聚糖含量改良的關鍵。表7

表7 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量相關性Table 7 The correlation analysis of oligosaccharide and its component contents in soybean

2.4 大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量聚類

研究表明，在歐氏距離為15時，可將其劃分為3類，其中第Ⅰ類屬于低聚糖及其組分含量較高類型，包括吉林3號、大粒黃、青雜豆、黑河9號、合豐29、黑河1號、寶豐8號、疆豐23-3412和呼交282共9個品種，該類品種低聚糖含量平均可達10.08%，其中以呼交282低聚糖含量最高(11.13%)；第Ⅱ類包括323個品種，屬于中間類型，其低聚糖含量平均為7.72%；第Ⅲ類屬于低聚糖及其組分含量較低品種，包括黑秣食豆、黑秣豆、吉育105和哈12-4547共4個品種，其低聚糖含量平均為6.54%。表8

表8 供試大豆品種資源籽粒低聚糖及組分含量聚類Table 8 The cluster analysis of oligosaccharide and its component contents in soybean

2.5 大豆籽粒低聚糖及組分含量特異種質遴選

研究表明，篩選出不同類型高、低含量特異種質各5份，包括低聚糖高含量特異種質合豐29、疆豐23-3412、青雜豆、大粒黃和呼交282，其含量均在10%以上；蔗糖高含量特異種質吉林3號、呼交282、寶豐8號、大粒黃、青雜豆，其含量均在5.59%以上；棉籽糖高含量特異種質疆豐23-3412、毛豆、合豐44等，其含量均高于1.86%；水蘇糖高含量種質黑秣豆(3.77%)和哈14-2146(3.87%)等。

篩選出低聚糖低含量特異種質賓縣黑豆、哈12-4547、綏農1號等，其含量均在6.29%以下；蔗糖低含量特異種質哈12-4547、吉育105、黑秣豆等，其含量均在2.85%以下；棉籽糖低含量特異種質黑秣食豆、吉育105等，其含量均低于0.56%；水蘇糖低含量特異種質綏無腥豆3號(0.95%)和合農69(1.08%)等。表9

3 討 論

研究利用高效液相色譜方法對供試336份大豆品種資源籽粒低聚糖及其組分含量進行鑒定，結果發現，蔗糖、棉籽糖、水蘇糖及低聚糖含量均值為4.01%、1.16%、2.60%和7.77%，與王曉巖[25]所測上述4種含量(4.56%、0.90%、3.39%、8.86%)、宋志峰等[12]所測4種含量(5.86%、1.01%、3.97%、10.84%)以及王曉巖等[13]所測Harosoy近等基因系在北京(4種含量4.493%、0.824%、3.243%、8.560%)和內蒙(4種含量5.663%、0.861%、3.398%、9.922%)兩地結果相比，低聚糖含量均值稍低，而棉籽糖含量稍高，這與供試品種資源以及光周期等環境因素有一定關系。

表9 遴選出的大豆籽粒低聚糖及組分含量特異種質Table 9 The selected soybean germplasms of oligosaccharide and its component contents

基于供試336份大豆品種資源低聚糖及其組分含量具體表現，研究篩選出各種類型特異種質共40個，其中包括高含量種質20個、低含量種質20個，其中低聚糖含量最高的品種為呼交282，其低聚糖總含量達到11.13%(一般品種低聚糖含量在8%左右)，且蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量也較高，可用于大豆籽粒低聚糖含量常規及分子遺傳改良。通過分析供試大豆品種資源籽粒低聚糖及其組分間的相關性，結果發現，低聚糖與3種組分間均存在極顯著正相關，蔗糖與棉籽糖之間也存在顯著相關，這與王曉巖[25]研究結果基本一致。

4 結 論

在流動相比例70∶30(乙腈：水)的情況下，能達到高效穩定的分離目的；供試東北生態區大豆種質低聚糖及其含量存在豐富的遺傳變異，具有較大的選擇潛力；供試群體低聚糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖之間相關系數達到顯著或極顯著水平；東北生態區種質篩選出低聚糖含量各種類型特異種質共40個，其中包括高含量種質20個、低含量種質20個。