HPLC法測定苗藥觀音座蓮中紫萁內酯苷的含量

封云倩，史辛夷，楊瓊亞，郎天瓊，羅國勇

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

苗藥觀音座蓮，別名馬蹄蕨，為觀音座蓮科觀音座蓮屬的植物福建觀音座蓮(AngiopterisfokiensisHieron.)的根，具有祛風解毒、止血之效[1-2]。現代藥理研究表明，觀音座蓮還具有抗HIV[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5-6]和改善心絞痛[7]等作用，極具開發價值。藥用資源的開發和利用，以建立可行的質量標準為前提。目前，觀音座蓮的質量標準僅包括水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物等方面[8]，缺少有效成分的含量控制。根據Taveepanich S等[3]的研究結果，紫萁內酯苷具有顯著抑制HIV-1逆轉錄酶的活性，并對肺癌細胞表現出顯著的細胞毒作用，表明紫萁內酯苷是觀音座蓮中潛在的活性組分。基于此，結合前期開展的化學成分研究結果，擬建立苗藥觀音座蓮中紫萁內酯苷的HPLC含量測定方法，以期為苗藥觀音座蓮的質量控制奠定基礎。同時，對葉子與根中紫萁內酯苷的含量差異進行比較分析，為觀音座蓮以根入藥提供了理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C高效液相色譜儀(日本島津公司)，超聲波清洗儀KQ-400KDB型(昆山市超聲儀器有限公司)，萬分之一電子分析天平(上海卓精電子科技有限公司)，數顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

1.2 材料

紫萁內酯苷對照品(實驗室前期分離)；實驗用苗藥觀音座蓮來源見表1，經貴州中醫藥大學趙俊華教授鑒定為觀音座蓮科觀音座蓮屬的福建觀音座蓮，植物標本存放于貴州中醫藥大學民族藥重點實驗室；甲醇為色譜純(美國TEDIA天地試劑公司)；磷酸為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；分析用水購于華潤怡寶飲料有限公司。

表1 苗藥觀音座蓮樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液等度洗脫(2∶98)；流速1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：220 nm；進樣量：2 μL。理論塔板數按紫萁內酯苷峰計算不低于11 360。

2.2 溶液配置

2.2.1 對照品溶液制備 稱取紫萁內酯苷對照品10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加入適量甲醇溶解，再加甲醇定容至刻度，搖勻即得1.094 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取福建觀音座蓮粉末0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密移取提取溶劑30%甲醇30 mL，稱定質量，50 ℃下，加熱回流提取1 h，冷卻后補重，過濾，取續濾液，過0.22 μm微孔濾膜即得供試品溶液。

2.3 專屬性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液按“2.1”項下方法進樣，在該色譜條件下，供試品中紫萁內酯苷與對照品色譜峰保留時間一致，與鄰峰分離度>1.5。說明該方法專屬性良好。色譜見圖1。

注：A：對照品溶液；B供試品溶液。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1.0 mL、1.8 mL、2.6 mL、3.4 mL、4.2 mL、5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，按“2.1”項下方法測定。以紫萁內酯苷濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=2 260 576.03X+4 710.3(Y為峰面積，X為對照品濃度)，r=0.999 9。紫萁內酯苷在0.101～0.505 mg/mL范圍內，線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液按“2.1”項下方法連續進樣6次，測得紫萁內酯苷峰面積的RSD為0.54%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

按“2.2.2”項下的操作制備福建觀音座蓮供試品溶液于室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，測得紫萁內酯苷峰面積的RSD為0.63%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

按“2.2.2”項下的操作平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，測得紫萁內酯苷峰面積的RSD為1.2%，表明該方法重復性良好。該批次樣品的平均含量為1.1%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的觀音座蓮末6份，每份0.25 g，含量按1.1%計算，精密量取1.034 mg/mL的紫萁內酯苷對照品溶液3 mL，分別加入6份樣品中，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，計算回收率。結果紫萁內酯苷平均回收率(n=6)為97.33%，RSD為2.02%，表明本方法具有較好的加樣回收率。見表2。

表2 加樣回收試驗結果

2.9 樣品含量測定

實驗前期對福建觀音座蓮的提取工藝進行考察，最終確定的提取方法為精密稱取觀音坐蓮粉末1 g，以20%的甲醇作為溶劑，料液比為1∶20，在40 ℃下，超聲時間為10 min，超聲功率為240 W。分別取11批次福建觀音座蓮的葉子與根共22個樣品按照上述提取方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行進樣分析，并計算含量。樣品含量測定結果見表3。

表3 11批次福建觀音座蓮的含量測定 (%)

2.10 統計學處理

表4 各組紫萁內酯苷的含量

表5 單因素ANOVA分析結果

3 討論

3.1 檢測波長選擇

在紫外檢測器220 nm及254 nm下進行掃描，發現在末端吸收220 nm下待測成分有良好的吸收，分離效果較理想，因此選擇220 nm作為檢測波長。

3.2 結果分析

通過對采集的11個批次藥材進行分析發現，葉子中紫萁內酯苷的含量顯著低于根中的含量(1.25% VS 3.97%；P<0.01)，這為苗藥觀音座蓮以根入藥提供了理論依據。導致葉和根中有效成分含量差異的原因可能有：①根莖類藥材宜在秋冬季節采摘，而葉類藥材則適合在其光合作用最強時采集。本次分析樣品均在秋季采樣，導致根中累積的紫萁內酯苷較多，而葉子的光合作用較弱，其紫萁內酯苷的含量較低。②在生長過程中，觀音座蓮的根部可能更有利于化學成分貯存。事實上，同一成分在同一植物的不同部位存在差異極其常見，如許婷等[9]通過對淫羊藿藥材葉片、葉柄及莖3個部位進行研究表明，其葉片中黃酮類成分含量顯著高于莖及葉柄；李紅娟等[10]的研究結果顯示，白茯苓、茯神與赤茯苓中三萜酸成分存在顯著差異，以后者的茯苓酸含量最高。

4 結語

基于HPLC，建立了苗藥觀音座蓮中活性成分紫萁內酯苷的含量測定方法。該方法簡便快速、準確可行，為該藥用資源的質量控制奠定了基礎。進一步的含量分析結果顯示，紫萁內酯苷在福建觀音座蓮根中的平均含量顯著高于其在葉子中的含量，這為苗藥觀音座蓮以根入藥提供了理論依據。