HPLC法測(cè)定三香跌打損傷酒中馬錢子堿和士的寧含量

孫建彬，越 亮，王 欣，胡 彬，彭 爽，羅維早*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.太極集團(tuán)重慶桐君閣制藥廠有限公司，重慶 401336)

三香跌打損傷酒由柴胡、當(dāng)歸、川芎、赤芍、黃岑、桃仁、五靈脂、骨碎補(bǔ)(燙)、續(xù)斷、馬錢子(沙燙)、蘇木、紅花、三棱、莪術(shù)、乳香(醋炙)組成，具有舒筋活血、散瘀止痛的功能，主要用于跌打塤傷、瘀血凝滯、紅腫疼痛、筋絡(luò)不舒等癥。該藥含有毒性中藥馬錢子，中藥馬錢子的生物堿成分馬錢子堿和士的寧有劇毒，士的寧和馬錢子堿對(duì)小鼠灌胃給藥的半致死量LD50分別為 3.27和233 mg/kg。士的寧成人一次服用5～10 mg 可致中毒，30～100 mg 可致死亡，兒童的致死量?jī)H為15～30 mg[1-2]。2020版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定馬錢子中士的寧的含量應(yīng)為1.20%～2.20%，馬錢子堿不得低于0.80 %[3]。馬錢子堿和士的寧作為該制劑中的有效成分和毒性成分，且士的寧治療劑量與中毒劑量非常接近，必須對(duì)其嚴(yán)格控制。本研究通過建立三香跌打損傷酒中馬錢子堿、士的寧的含量測(cè)定方法，為其制定合理的限度。

1 儀器與試藥

島津LC-20 A型高效液相色譜儀；CPA225D型電子天平：十萬分之一，Sartorius；PB-10 pH計(jì)，Sartorius。馬錢子堿對(duì)照品(批號(hào)：110706-200505，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，士的寧對(duì)照品((批號(hào)：110705-200306，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，三香跌打損傷酒(批號(hào)：2018070001、2018070002、2019 050001、2019050002、2019050003、2019050004、2019050005、2019050006、2019050007、2019050 008)及三香跌打損傷酒-馬錢子陰性樣品(批號(hào)：2019050009)由太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司提供，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Gemini-NX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈(A)-50 mmol/L碳酸氫氨(氨水調(diào)節(jié)pH=9.5，B)，按表1要求進(jìn)行梯度洗脫，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm。在上述色譜條件下，馬錢子堿、士的寧之間以及與其他組分之間分離度良好，馬錢子堿、士的寧的理論塔板數(shù)均>5 000，見圖1、圖2。

表1 梯度洗脫

注：A 混合對(duì)照品；B 三香跌打損傷酒；C 三香跌打損傷酒-馬錢子陰性。

注：A混合對(duì)照品；B三香跌打損傷酒。

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

分別取馬錢子堿約10 mg、士的寧約12 mg，精密稱量，置50 mL容量瓶中，用60%乙醇制成每1 mL含有212.2 μg馬錢子堿、252.6 μg士的寧的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用60%乙醇稀釋20倍，制成含馬錢子堿10.61 μg、士的寧12.63 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品2 mL至10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.4 線性范圍

將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液依次稀釋2倍，取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液及其各稀釋液進(jìn)樣。以樣品濃度對(duì)峰面積的積分值進(jìn)行線性回歸處理，得馬錢子堿、士的寧回歸方程，結(jié)果表明馬錢子堿、士的寧在該條件下線性良好，結(jié)果見表2。

表2 馬錢子堿、士的寧回歸方程及線性范圍

2.5 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定

將馬錢子堿和士的寧最低濃度對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，注入液相色譜儀，觀察其信噪比(即S/N)，當(dāng)S/N≈3時(shí)，此時(shí)的濃度為檢測(cè)限，當(dāng)S/N≈10時(shí)，此時(shí)的濃度為定量限，結(jié)果見表3。

表3 馬錢子堿、士的寧的檢測(cè)限和定量限

2.6 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄馬錢子堿、士的寧的峰面積，結(jié)果表明精密度良好，結(jié)果見表4。

表4 精密度測(cè)定結(jié)果(按峰面積積分值計(jì))

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取三香跌打損傷酒(批號(hào)：2019050004)，按“2.3”項(xiàng)下要求制備樣品6份，10 μL，測(cè)定馬錢子堿、士的寧的含量，結(jié)果表明三香跌損傷酒在該條件下重復(fù)性良好，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取三香跌打損傷酒(批號(hào)：2019050004)，按“2.3”項(xiàng)下要求配制后分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄馬錢子堿、士的寧的峰面積，結(jié)果見表6。結(jié)果表明處理后的樣品在1 d內(nèi)穩(wěn)定。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(按峰面積積分值計(jì))

2.9 加樣回收率

精密量取三香跌打損傷酒(批號(hào)：2019050004)1 mL至10 mL容量瓶，加入馬錢子堿和士的寧濃度分別為53.05 μg/mL、63.15 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，過濾。測(cè)定馬錢子堿、士的寧含量，計(jì)算加樣回收率。馬錢子堿、士的寧的平均回收率及RSD%見表7。各組分的RSD%≤2.0%，表示測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表7 三香跌打損傷酒的加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.10 三香跌打損傷酒含量測(cè)定

取10批次三香跌打損傷酒，按“2.3”項(xiàng)下要求制備樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)馬錢子堿、士的寧含量，結(jié)果見表8。

表8 三香跌打損傷酒的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 結(jié)論

2020版《中國(guó)藥典》馬錢子含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)(21∶79)，含馬錢子的成方制劑中也大多使用此流動(dòng)相，文獻(xiàn)中關(guān)于馬錢子的中藥品種大多采用此含量測(cè)定方法[4-7]。但此流動(dòng)相含有離子對(duì)試劑，配制較為復(fù)雜，使用不當(dāng)易造成基線不穩(wěn)、峰分叉等問題。文獻(xiàn)中有關(guān)馬錢子堿、士的寧含量測(cè)定方法，流動(dòng)相大多為酸性條件(磷酸或醋酸調(diào)節(jié)pH為2～3)[8-9]。在研究中發(fā)現(xiàn)，使用酸性條件的流動(dòng)相，馬錢子陰性有干擾，且會(huì)有峰形拖尾，甚至分叉的現(xiàn)象發(fā)生。考察了堿性環(huán)境流動(dòng)相(氨水調(diào)節(jié)pH至9.5)，發(fā)現(xiàn)峰形對(duì)稱性好；通過比較乙酸銨溶液、碳酸氫氨溶液作為流動(dòng)相對(duì)分離度的影響，發(fā)現(xiàn)碳酸氫氨分離度能夠達(dá)到要求，且陰性無干擾。

使用PDA檢測(cè)器，士的寧光譜圖顯示其最大吸收波長(zhǎng)為255 nm，而馬錢子堿最大吸收波長(zhǎng)為265 nm，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為260時(shí)，士的寧峰面積變化不大，而馬錢子堿峰面積變大較多，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，可兼顧士的寧、馬錢子堿檢測(cè)，與2020版《中國(guó)藥典》馬錢子含量測(cè)定項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)一致。

三香跌打損傷酒中使用的是馬錢子炮制品，考慮到士的寧的治療窗較窄，應(yīng)嚴(yán)格限定其含量。結(jié)合本品制備特點(diǎn)及10批次樣品含量測(cè)定結(jié)果，規(guī)定本品每 1 mL含士的寧應(yīng)為50～75 μg，馬錢子堿應(yīng)不少于40 μg，其中士的寧的成人每日最大使用劑量少于中毒劑量5 mg。

本研究建立了三香跌打損傷酒中馬錢子堿、士的寧的含量測(cè)定方法，該方法分離度達(dá)到含量測(cè)定要求，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在2%以內(nèi)，且符合藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，證實(shí)該方法準(zhǔn)確可靠。