蘭香草中總黃酮和木犀草素提取工藝優化及其含量動態分析

郭 慶，陳美安，張欣影，李宗澤，黃星海

(廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530001)

蘭香草，為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草(Caryopterisincana(Thunb.) Miq.)的全草或帶根全草[1]，其別名較多，比較常見的有婆絨花、石母草、段菊等。蘭香草藥用資源豐富，易采集，我國有13種、2變種、1變型，主要分布于廣西、廣東、湖南、江西等地，其味辛，氣香，性微溫，具有疏風解表、祛寒除濕、散瘀止痛之功效，可用于治療風寒感冒、慢性支氣管炎、皮膚瘙癢、風濕痹痛、跌打腫痛、外傷出血等癥[2-4]。現代藥理研究表明蘭香草有抗氧化、抗炎、抗菌、止咳、祛痰等作用[5-8]，蘭香草全草中含有精油、生物堿、黃酮、酚酸、氨基酸、甾體、有機酸、鞣質等成分，其中黃酮類成分含量最多[9-10]，具有良好的藥用價值。課題組前期從蘭香草乙酸乙酯部位中分離出若干個黃酮類化合物，其中1個鑒定為木犀草素[11]。目前，關于蘭香草的化學成分、提取工藝、質量分析等研究報道甚少，且尚未見其黃酮類成分含量動態積累研究的報道，亦無統一種植和采收規范標準，難以保證市場上蘭香草藥材的質量。因此，本文采用正交試驗優化提取蘭香草中總黃酮和木犀草素的工藝，為其提取工藝研究奠定一定基礎。同時，探討蘭香草中總黃酮和木犀草素含量在不同采收期的動態變化趨勢，明確其含量與采收時間之間的關系，為指導蘭香草藥材的合理采收，后續藥理活性、質量分析及藥用價值的開發利用等方面奠定了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12個不同月份蘭香草藥材，經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室朱意麟藥師鑒定為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草(Caryopterisincana(Thunb.) Miq.)的干燥全草，陰干，粉碎成粗粉，備用。

表1 蘭香草藥材信息

蘆丁對照品(規格：20 mg/支，供含量測定用，純度：98%，批號：100080-201811，中國藥品生物制品檢定所)；木犀草素對照品(規格：20 mg/支，供含量測定用，純度：98%，批號：111520-201605，中國藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇均為色譜純(美國Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；JADE-PAK ODS-AQ C18色譜柱(5μm，250 mm×4.6 mm，太瑋科技)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；TGL-16B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-III循環水式多樣真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；UPC-11-10T實驗室超純水器(四川優譜超純科技有限公司/成都超純科技有限公司)。

1.2 總黃酮含量測定

1.2.1 溶液制備 取干燥至恒重的蘆丁對照品約3 mg，精密稱定，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成濃度為0.296 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液。取蘭香草粉末約1 g，精密稱定，稱重，按一定條件超聲提取，放冷，用提取溶劑補足重量，搖勻，定量過濾，定容至100 mL容量瓶中，即得供試品溶液Ⅰ。

1.2.2 線性關系考察 分別精密吸取“1.2.1”項下蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，充分振搖后放置5 min，精密加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，充分振搖后放置5 min，精密加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用甲醇定容至刻度，充分振搖后放置15 min。以甲醇作空白，在500 nm測定相應溶液吸光度(A)。以蘆丁對照品濃度(C，mg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。求得蘆丁的回歸方程為：Y=12.874 9X-0.006 189 98(r=0.999 9)。結果表明對照品溶液在0～0.059 2 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁對照品標準曲線

1.3 木犀草素含量測定

1.3.1 溶液制備 取干燥至恒重的木犀草素約3 mg，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成濃度為120μg/mL的木犀草素對照品溶液。取供試品溶液Ⅰ40 mL，濃縮至干，定容至2 mL容量瓶中，即得供試品溶液Ⅱ。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：JADE-PAK ODS-AQ 柱(5μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸(55∶45)；檢測波長：350 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10μL。木犀草素的色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.90～1.05之間；理論塔板數按木犀草素計均大于10 000，滿足定量要求。色譜見圖2和圖3。

圖 2 木犀草素對照品高效液相色譜

圖 3 蘭香草供試品高效液相色譜

1.3.3 線性關系考察 精密吸取“1.2.1”項下木犀草素對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按“1.3.2”項下色譜條件，分別取上述6個不同濃度的對照溶液注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以木犀草素對照品溶液進樣濃度(C，μg/mL)為橫坐標，色譜峰峰面積(A)為縱坐標，繪制標準工作曲線，求得木犀草素的回歸方程為：Y=55.461 624 7X-30.948 509(r=0.999 9)。結果表明對照品溶液在6～60μg/mL濃度范圍內線性關系良好。木犀草素標準曲線見圖4。

圖4 木犀草素對照品標準曲線

1.4 蘭香草總黃酮和木犀草素提取工藝優化

1.4.1 單因素實驗 稱取同一批次編號C6蘭香草粉末，每份約1 g，精密稱定，固定其他因素不變的條件下，分別考察提取溶劑(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇)，料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)，提取時間(30、60、90、120 min)和提取次數(1次、2次、3次)等四個因素對蘭香草提取總黃酮含量和木犀草素含量的影響，以篩選出各因素最優提取條件。

1.4.2 正交實驗 稱取同一批次編號C6蘭香草粉末，每份約 1 g，精密稱定，根據單因素實驗結果，以蘭香草中總黃酮含量和木犀草素含量的綜合評分為考察指標，選擇乙醇濃度(A)、物料比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)作為考察因素，采用L9(34)正交實驗設計進行實驗，因素水平見表2。

表2 L9(34)正交實驗設計

1.5 蘭香草總黃酮和木犀草素含量動態測定

分別稱取12個不同月份的蘭香草粉末，各3份，每份約1 g，精密稱定，按“1.2.1”項下和“1.3.1”項下方法平行制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液Ⅰ2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.2”項下所述方法進行測定，計算總黃酮的含量及RSD值；精密吸取供試品溶液Ⅱ10μL，按“1.3.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算木犀草素的含量及RSD值。

總黃酮的含量(mg/g)= (C1×V1×N1)/m，式中，C1為樣品中總黃酮的濃度，mg/mL；V1為測定時定容的體積，mL；N1為稀釋倍數；m為生藥材量。

木犀草素的含量(μg/g)= (C2×V2×N2)/m，式中，C2為樣品中木犀草素的濃度，mg/mL；V2為測定時定容的體積，mL；N2為稀釋倍數；m為生藥材量。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 提取溶劑的影響 結果見圖5和圖6，可知乙醇和甲醇在相同濃度的條件下，以不同濃度乙醇的提取量相對較高；其中，在不同乙醇濃度中，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮和木犀草素提取量不斷增大，當乙醇濃度增加至70%時提取量達到最高值，此時再繼續增加乙醇濃度，提取量反而降低。因此采用70%乙醇作為提取溶劑。

圖5 提取溶劑對總黃酮含量的影響

圖6 提取溶劑對木犀草素含量的影響

2.1.2 料液比的影響 結果見圖7和圖8，料液比按照10倍量不斷遞增考察，發現隨著溶劑量的增加，總黃酮和木犀草素提取量先升高，當料液比為1∶40 g/mL時達到最高值后再降低。可能原因是增加溶劑量過多，導致其他成分溶出量增加，反而影響了指標成分的溶出。因此采用料液比為1∶40最適宜。

圖7 料液比對總黃酮含量的影響

圖8 料液比對木犀草素含量的影響

2.1.3 提取時間的影響 結果見圖9和圖10，當提取時間為60 min時，總黃酮和木犀草素提取量最高，繼續延長提取時間，反而有稍有降低，趨于平穩。在60 min左右，溶解藥材組織細胞內外指標成分的濃度達到動態平衡，因此采用提取時間為60 min最適宜。

圖9 提取時間對總黃酮含量的影響

圖10 提取時間對木犀草素含量的影響

2.1.4 提取次數的影響 結果見圖11和圖12，當提取次數為2次時，有利于總黃酮和木犀草素的溶出，提取量最高。因此采用提取次數為2次最適宜。

圖11 提取次數對總黃酮含量的影響

圖12 提取次數對木犀草素含量的影響

2.2 正交實驗結果與分析

正交實驗結果及方差分析見表3和表4。由表3可知，R值越大，表明該因素的水平變動對試驗結果的影響越大，四因素對蘭香草總黃酮和木犀草素提取影響的順序為乙醇濃度(A)>提取次數(D)>提取時間(C)>料液比(B)。由表4可知，四個因素對蘭香草總黃酮和木犀草素含量的提取均無顯著性差異(P>0.05)。綜合考慮最佳提取工藝條件組合為：A2B2C2D2，即乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取時間為60 min，提取次數為2次。

表3 正交實驗結果

表4 正交試驗方差分析結果

2.3 驗證試驗

為進一步考察提取工藝的穩定可靠，稱取同一批次編號C6蘭香草粉末3份，每份約1 g，精密稱定，根據“2.2”項下正交實驗優化得到的最佳提取工藝進行驗證試驗。此工藝條件下總黃酮和木犀草素含量，結果見表5。

表5 正交試驗驗證結果

2.4 蘭香草總黃酮和木犀草素含量動態測定結果與分析

結果見表6、圖13和圖14，不同采收期蘭香草藥材中總黃酮及木犀草素含量不同，兩者總體變化趨勢均隨著藥材生長不斷遞增，1月和2月含量最低，9月達到峰值(總黃酮平均含量為96.95 mg/g，RSD為0.50%；木犀草素平均含量為226.48μg/g，RSD為1.05%)，之后逐漸減低。其中，總黃酮和木犀草素含量1月與2月無顯著性差異(P>0.05)，但與其他采收時間差異顯著(P<0.01)；總黃酮含量9月與其他采收時間差異顯著(P<0.01)；木犀草素含量8月與9月無顯著性差異(P>0.05)，但與其他采收時間差異顯著(P<0.01)。

表6 不同采收期蘭香草中總黃酮和木犀草素含量測定結果

圖13 不同采收期蘭香草中總黃酮含量

圖14 不同采收期蘭香草中木犀草素含量

3 討論

蘭香草為壯族民間常用草藥，目前尚未明確蘭香草的藥效成分，但蘭香草中含有豐富的黃酮類成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、鎮痛、降血糖、心血管系統保護及防治阿爾茨海默病等藥理活性[12-16]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，存在于許多中藥中，課題組前期從蘭香草中分離鑒定出來木犀草素，在蘭香草中含量比較高，同樣具有很好的藥理活性，如抗過敏、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、心臟保護和神經保護等[17-21]，臨床主要用于治療肝炎、心血管疾病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、降尿酸和止咳化痰等。因此，本實驗選擇總黃酮和木犀草素作為評價蘭香草藥材質量的重要指標之一，建立其含量測定方法，優化提取工藝，并分析其含量動態積累變化趨勢，以指導該藥材制定合理采收時間。

在含量測定方法建立中，采用紫外-可見分光光度法總黃酮含量測定，以蘆丁為對照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH作為顯色系統，使蘆丁的鄰二酚羥基形成絡合物而顯色，在500 nm處有最大吸收。同時，采用高效液相色譜法木犀草素含量測定，并對流動相和檢測波長這兩個色譜條件進行了摸索。流動相曾考察了乙腈-水(28∶72)、甲醇-水(45∶55)、乙腈-0.2%磷酸溶液(28∶72)、甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)，結果表明以甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)為流動相時，圖譜基線平緩，木犀草素的響應值好，峰形好，與相鄰色譜峰分離度好，理論塔板數、拖尾因子等均符合要求。檢測波長的選擇，采用二極管陣列檢測器在波長為190～400 nm范圍內進行掃描，發現木犀草素在254 nm和350 nm處有最大紫外吸收，因此本實驗根據掃描結果結合文獻報道考察了254 nm、280 nm、350 nm、360 nm這4個不同波長圖譜情況，結果表明在350 nm處測定時，木犀草素有較強吸收，且干擾甚少，圖譜特征性也很強。另外，進行了總黃酮和木犀草素含量測定的方法學考察，結果表明本測定方法儀器精密度好，操作簡便、穩定可行，可作為蘭香草中總黃酮和木犀草素含量測定的方法。

提取工藝優化考察，根據此單因素試驗結果，選擇乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數作為考察超聲提取的四個影響因素，采用L9(34)正交實驗優化提取蘭香草總黃酮和木犀草素的最佳工藝，結果顯示最佳超聲提取工藝條件為：乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取時間為60 min，提取次數為2次。正交實驗結果剛好跟單因素考察結果是一致的，提示該超聲提取工藝簡單合理、提取率高、穩定性好，為蘭香草工業化生產奠定了實驗基礎。

蘭香草的藥用部位是全草或帶根全草，1月和2月為休眠期，植株枯萎倒塌，此時總黃酮和木犀草素含量是最低的。3月初蘭香草種子萌芽展葉，植株非常小，總黃酮和木犀草素含量低。隨著月份增加，4-5月不斷抽生新枝展葉生長，植株逐漸長高，總黃酮和木犀草素含量有所增加。6-8月為植株營養生長旺盛期，枝條迅速抽長，株高和冠幅增長也非常快，總黃酮和木犀草素含量增加幅度很大。8月底進入生殖生長期，9月底植株達到最大生長高度，總黃酮和木犀草素含量達到最大值，且木犀草素含量在8月與9月無顯著性差異(P>0.05)。由此可知，在營養生長旺盛和生殖生長期，陽光和雨水充足，溫度適宜，植株生長迅速，利于總黃酮和木犀草素的生物合成。10月開始，天氣逐漸轉涼，總黃酮和木犀草素含量逐漸降低，12月植株地上部分枯萎落葉，進入休眠期，其含量大幅度降低。因此，本實驗認為廣西宜州蘭香草藥材的采收，以總黃酮含量為評價指標時，9月采收最佳；以木犀草素含量為評價指標時，8月和9月采收最佳。