石菖蒲-茯苓合用治療阿爾茨海默癥作用機制探討

吳 婷，李萬敏，李勛章，邸 學，王海波

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種進行性神經系統退行性疾病，易發于老年人群。該病臨床主要表現為記憶力衰退、認知功能障礙、行為障礙、判斷能力及性格行為異常等。目前認為其發病機制包括β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應、膽堿能缺失、氧化應激、金屬離子紊亂、胰島素抵抗、粒體功能障礙及菌群-腸-腦軸失調等[1-2]。

在中醫學中，AD歸屬于“癡呆”“呆病”等范疇，常以“益氣健脾、化痰開竅”“活血化瘀、豁痰開竅”等治法進行治療，常用方劑包括地黃飲子、開心散及當歸芍藥散等[3]。經典方劑開心散、地黃飲子等古方中以茯苓、石菖蒲配伍使用，而現代腦腸軸理論為其應用機制提供了新闡述。腦腸軸是腦-腸相互作用雙向調節軸，其上行調節的途徑包括神經途徑、體液途徑和免疫途徑[4]，是中樞神經系統在很多方面與胃腸道神經系統互相鏈接的表現[5]。腸道可以參與中樞神經系統的調控機制，如益生元、益生菌等可引起tau蛋白過度磷酸化、β-淀粉樣蛋白沉積等與神經系統病變相關反應[6]。因此，分析常配伍使用的調理胃腸藥物茯苓與醒神開竅藥物石菖蒲的聯合作用機制，有助于AD治療創新藥物的研發。

石菖蒲屬開竅藥，為天南星科植物石菖蒲(AcortwtatarinowiiSchott)的干燥根莖，其味苦，微辛，入心、胃經，具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智之功效，對心腎失養所致的耳鳴、失眠、健忘有療效，常作為治療腦病的必備藥物[7]。茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核，其性平，味甘、淡，入心、肺、脾、腎經，具有利水滲濕、健脾、寧心之功效，還具有利尿、抗腫瘤、抗菌、改善記憶及抗氧化的藥理作用[8]。

網絡藥理學融合多學科技術及內容，構建、整合“疾病-表型-基因-藥物”多層次網絡[9]，與中藥多組分、多途徑、多靶點協同調節的作用模式極為相關[10]。因此，基于腦腸軸理論，以石菖蒲醒神開竅作用于“腦”及茯苓利水滲濕健脾功效為探討對象，開展網絡藥理學研究，分析石菖蒲-茯苓合用治療AD疾病的中樞神經系統與胃腸道作用的綜合機制，為今后治療AD疾病提供新參考。

1 材料

數據庫：中藥系統藥理數據庫(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，PubChem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/443027)，SwissTargetPrediction數據庫(http：//swisstargetprediction.ch/)，STRING數據庫(http：//string-db.org)，DisGeNET數據庫(http：//www.disgenet.org/search)，DrawVen nDiagram數據庫(bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)，KEGG數據庫(http：//www.kegg，jp)，DAVID數據庫(http：//david.ncifcrf.gov)，Omicshare在線平臺(https：//www.omicshare.com/)。

2 方法與結果

2.1 石菖蒲-茯苓活性成分篩選

通過TCMSP數據庫檢索“石菖蒲”和“茯苓”化學成分，得到石菖蒲的化合物105個，茯苓的化合物34個。以口服生物利用度(OB)值≥30%，類藥性(DL)值≥0.1為條件進行篩選，得到31個候選化合物，見表1。

表1 石菖蒲(A)-茯苓(P)的活性化合物

2.2 候選化學成分靶點預測

經SwissTargetPrediction數據庫及TCMSP數據庫檢索分析得到化合物的基因靶點，對比、去重，得到486個基因靶點。

2.3 獲取AD相關靶點

通過DisGeNET數據庫，以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞，檢索到AD相關靶點3 397個。

2.4 中藥藥對-疾病靶點構建

將“2.2”項中所得化合物預測基因靶點與“2.3”項中的疾病基因靶點導入DrawVennDiagram數據庫，繪制韋恩圖，獲得石菖蒲-茯苓藥對作用于AD疾病的潛在基因靶點，確定石菖蒲-茯苓藥對作用于AD疾病的潛在作用基因靶點為286個，見圖1。

圖1 中藥藥對-疾病靶點

2.5 靶點KEGG通路分析

將“2.4”項中交集靶點分別輸入KEGG數據庫、DAVID數據庫和STRING數據庫，進行KEGG通路富集及靶點基因的相互作用分析。

富集到通路為130條，以基因數為篩選條件，選擇癌癥通路(Pathways in cancer)、刺激神經組織的配體受體交互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)通路及PI3K-Akt信息通路(PI3K-Akt signaling pathway)等10條通路，見表2。利用Omicshare在線平臺繪制前10條KEGG網絡圖，見圖2。Degree>4的主要通路為PI3K-Akt signaling pathway和Calcium signaling pathway。而4條以上通路出現基因互擾作用有32個，其中有MAPK3、CHRM1、MAPK8及ADORA2A等7個基因是石菖蒲與茯苓化合物共同通過不同通路作用于AD疾病的主要基因靶點，見表3。

圖2 KEGG網絡分析

表2 石菖蒲-茯苓治療AD潛在基因靶點的主要通路

表3 石菖蒲-茯苓作用通路共同基因

靶點基因相互作用分析，選擇Homo sapiens，設置參數值high confidence(0.70)，見圖3。其中Degree>5有10個，分別為HSP90AA1、EGFR、HSP90AB1、JAK2、EP300、ESR1、ESR2、FKBP4、ITGB3、LYN，見圖4。

圖3 潛在靶點基因的相互作用

圖4 核心靶點相互作用

2.6 成分-核心靶點-通路網狀模型構建

利用Cytoscape 3.6.0軟件構建“成分-潛在靶點-通路”之間的網絡模型圖，進一步觀察候選成分、潛在作用靶點及所涉及通路的關系，見圖5。

圖5 成分-核心靶點-通路網絡

石菖蒲-茯苓活性成分的核心作用靶點分布于不同代謝通路，相互協調作用，涉及多種機制，這體現了藥對抗AD的作用。通過度的均值，選擇大于均值的藥對化合物有19個，見圖6。其中Degree>35有Cerevisterol(啤酒甾醇)和kaempferol(山柰酚)，預測兩化合物為石菖蒲-茯苓治療AD主要化合物，其次為2′-O-Methylisoliquiritigenin(2′-O-甲基異甘草素)、8-Isopentenyl-kaempferol(8-異戊烯基-山柰酚)及trametenolic acid(栓菌酸)等17個。

圖6 核心化合物-度值

3 討論

通過網絡藥理學分析方法，探索石菖蒲-茯苓的藥效作用，分析潛在的有效成分作用于生物網絡中多條通路、多個靶點的情況，解析其干預疾病發生發展的作用過程。本研究篩選出石菖蒲與茯苓主要作用于AD的化合物為異菖蒲烯二醇(Isocalamendiol)、土青木香酮(Aristolone)、菖蒲烯二醇(Calamendiol)、山柰酚(Kaempferol)、2′-O-甲基異甘草素(2′-O-Methylisoliquiritigenin)、呋喃香豆素(Marmesin)、8-異戊烯基-山柰酚(8-Isopentenyl-kaempferol)、常春藤皂苷元(hederagenin)、栓菌酸(trametenolic acid)、啤酒甾醇(Cerevisterol)及齒孔菌酸(3beta-Hydroxy-24-methylene-8-lanostene-21-oicacid)11種。石菖蒲活性成分主要是揮發油、萜類及黃酮類化合物。石菖蒲揮發油可以改善學習記憶能力，對神經細胞有保護作用[11-12]。異菖蒲烯二醇、土青木香酮及菖蒲烯二醇是石菖蒲揮發油的活性成分，菖蒲烯二醇是進入腦組織中的脂溶性去癡靈成分[13]。黃酮類化合物山柰酚具有抗氧化，抗炎及預防腦I/R誘導的腦損傷的作用[14]。茯苓的主要化學成分是三萜類和多糖類，萜類成分具有抗炎、降血糖、抗氧化及免疫調節等藥理作用[15]，常春藤皂苷元、栓菌酸及齒孔菌酸即為三萜類化合物，可能是其活性成分。

石菖蒲與茯苓的有效活性成分通過多條通路作用的相同基因靶點有MAPK3、MET、ADORA2A、CHRM1、CHRM2、KDR、MAPK8等。文獻資料表明，MAKP3、CHRM1、ADORA2A及MAPK8靶點與神經功能作用有關，MAKP3(絲裂原激活的蛋白激酶3)是一種抗凋亡基因，參與神經元的可塑性，對于用外皮素治療后大鼠海馬中的Mapk3表現出明顯的下調作用[16]。而CHRM1(膽堿能受體M1)是中樞神經系統中最重要的毒蕈堿受體，在神經元中高度表達，對CHRM1基因的敲除可減少NREM睡眠[17]，其減少也可影響手術絕經期惡化的記憶功能[18]及CHRM1基因表達被抑制后會削弱表達突變亨廷頓舞蹈病(HD)蛋白的穩定細胞系中Ca2+依賴的神經元信號轉導[19]。ADORA2A(腺苷受體亞型A2a)是一種G蛋白偶聯的腺苷受體，與海馬體積變化具有顯著關系[20]。因此，可推測這些基因可以作為今后治療神經退行性疾病和認知能力下降的潛在靶標。

經通路富集分析可知，石菖蒲-茯苓藥物作用以PI3K-Akt 信息通路和Ca2+信息通路2條通路為主，這2條通路與神經保護相關[21-23]。如山柰酚，可通過降低PI3K/Akt信號通路磷酸化水平進而促進細胞凋亡[24]，同時其對3T3-L1脂肪細胞的PI3K-Akt信號通路具有劑量相關的雙向調節作用[25]。

綜上，分析石菖蒲-茯苓不同成分、基因靶點和通路的不同作用方式，可為石菖蒲-茯苓合用干預AD疾病的研究與治療提供參考。