臍帶血冷凍前、小管復蘇及大袋復蘇后造血功能的比較

吳潔瑩 陳勁松 吳韶清 陸 琰 湯雪薇 李 焱

廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心廣州臍血庫(廣州 510623)

作為除骨髓和外周血干細胞外的另一移植供體來源，以實物形式置于液氮中長期凍存的臍帶血，具有采集方便、來源廣泛、可根據患者需求隨時解凍回輸等優勢。但是，與“新鮮”樣本不同，冷凍和復蘇時細胞外環境的變化會導致細胞活性降低；隨著凍存時間的延長，細胞的造血功能也會受到影響[1- 3]。根據現行的全球先進輸血和細胞治療聯盟(Advancing Transfusion and Cellular Therapies Worldwide，AABB)細胞治療服務標準(第9 版)的規定，臍血產品至少需要兩個完整的附屬血辮與產品一起冷凍保存，用于造血重建的產品在附屬連接段取樣檢測集落形成單位和(或)CD34 陽性細胞(直接測量)[4]。每份臍帶血產品體積有限、細胞珍貴，可供檢測的樣本通常僅數百微升。本文擬探討從冷凍袋附屬小管取樣，是否可用于臍帶血產品的質量控制及臍帶血移植供體發放前復核。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2009年3月—2021年2月在廣州臍血庫保存的53份臍帶血樣本(包括主袋和附屬小管)為研究對象，分別于2014年6月—2021年3月冷凍復蘇。根據取材部位和檢測時間，分為冷凍前、小管復蘇和大袋復蘇組。

1.2 主要試劑與儀器

IMDM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司， DNA酶購自美國Promega公司，臺盼藍溶液購自Sigma公司，甲基纖維素半固體培養基購自加拿大Stemcell公司，流式抗體：CD45-異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)、CD34-藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)、免疫球蛋白(IgG)-PE、7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)及溶血素購自美國BD公司。 生物潔凈工作臺購自蘇州蘇靜安泰空氣技術有限公司，型號：BCM-1600A；低溫高速離心機購自美國IEC公司，型號：GP8R；流式細胞儀購自美國BD公司，型號：BD FACS Canto Ⅱ；血細胞分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司，型號：Ac.T diff2；恒溫水浴箱購自美國Coring公司，型號LSE waterbath 6L；旋渦震蕩儀購自美國IKA公司，型號：LAB Dancer S25；醫用冷藏箱購自海信(北京)電器有限公司，型號：BCD-196TA；CO2培養箱購自德國Labotect公司，型號：C200；倒置顯微鏡購自日本Olympus及Nikon公司，型號：CHK及TE300。

1.3 方法

1.3.1 樣本復溫 將臍血自液氮液相中移至氣相，放置5 min。打開鋁夾，取出臍血冷凍袋的附屬血辮，避免彎折。將附屬血辮浸入恒溫水浴箱，溫度設置在37 ℃～42 ℃，輕輕晃動小管，數秒后取出，快速完成復溫。用無菌注射器抽取100 μL樣本用于有核細胞計數、活率檢測，其余樣本約400～500 μL轉移至15 mL無菌離心管，緩慢加入預冷的含2%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和10 U/mL DNase的IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Media) 培養基5 mL，輕輕搖動離心管。置10 ℃條件下，1 500 r/min、離心10 min。重懸細胞沉淀，再次洗滌離心。加入IMDM培養基重懸細胞，用于CD34陽性細胞檢測和干/祖細胞集落培養。大袋復蘇與小管復溫步驟基本相同，置水浴箱中2 min內完成復溫。

1.3.2 樣本檢測 有核細胞計數：采用全自動血細胞分析儀進行檢測。讀取屏幕上顯示的白細胞(white blood cell, WBC)數值，細胞總數=WBC×臍血體積。細胞活率檢測：采用0.4%臺盼藍染色檢測活細胞數量，計數100個有核細胞，被染色的為死細胞，未染色的為活細胞，根據臺盼藍拒染率，計算活細胞比例。CD34陽性細胞計數：標記流式管，設同型對照，將制備好的細胞懸液各50 μL分別加入對照管及實驗管，對照管加入10 μL CD45-FITC及10 μL IgG-PE熒光抗體，實驗管加入10 μL CD45-FITC及10 μL CD34-PE熒光抗體，避光孵育20 min。各管分別加入5 μL 7-AAD，繼續孵育5 min。再加入溶血素2 mL，室溫避光孵育10 min。于1 500 r/min離心5 min，棄上清，再加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液，于1 500 r/min離心5 min，棄上清，再以300 μL磷酸緩沖鹽溶液重懸細胞沉淀，上機檢測。分析結果得到CD34陽性細胞占CD45陽性有核細胞的百分比，再根據復溫后臍血的細胞總數，計算出每份臍血中的CD34陽性細胞的數量。造血祖細胞集落分析：采用MethodCult?GF H4434半固體甲基纖維素培養基，以105細胞/mL的密度接種于12孔板中，每孔終體積1 mL，每標本設雙復孔。置37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養14～16 天。倒置顯微鏡下觀察粒-巨噬細胞集落形成單位(colony-forming units-granulocyte/macrophage, CFU-GMs)、爆式紅細胞集落形成單位(burst-forming unit-erythroid, BFU-E)和粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落形成單位(colony-forming unit-granulocyte/erythrocyte/macrophage/mega-karyocyte, CFU-GEMM)，分別計數每105細胞中的各系集落數量，求和得到祖細胞集落形成單位總數(colony-forming unit, CFUs)，再根據復蘇臍血的細胞總數，計算出每份臍血中的集落數量。

1.4 觀察指標

選擇兩種方法制備的樣本在冷凍前后的總有核細胞數(total nucleated cells，TNCs)、細胞活率、CD34陽性細胞活率、CD34陽性細胞數量、CFU-GMs及CFUs數量為觀察比較的指標，細胞活率的計算公式如下：

TNCs細胞活率(%)=[活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)]×100%

CD34陽性細胞活率(%)=(7-AAD陰性/CD34陽性細胞數)/[(7-AAD陰性/CD34陽性細胞數)+(7-AAD陽性/CD34陽性細胞數)]×100%[5]

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 臍血復蘇后(小管)和冷凍前的各項參數的比較

復蘇后(小管)的總有核細胞數、細胞活率、CFU-GMs及CFUs數量較冷凍前均有所降低，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.001，P=0.039，P=0.019)，而二者的CD34陽性細胞數基本相似，差異無統計學意義(P=0.821)，見表1。

表1 臍血復蘇后(小管)和冷凍前的各項參數的比較

2.2 臍血復蘇后(大袋)和冷凍前的各項參數的比較

復蘇后(大袋)的總有核細胞數、細胞活率較冷凍前均有所降低、CFUs數量略高于冷凍前，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.001，P=0.013)，而二者的CD34陽性細胞數及CFU-GMs基本相似，差異無統計學意義(P=0.646，P=0.136)，見表2。

表2 臍血復蘇后(大袋)和冷凍前的各項參數的比較

2.3 臍血復蘇后(小管)和復蘇后(大袋)的各項參數的比較

復蘇后(小管)的總有核細胞數、細胞活率、CD34陽性細胞活率、CFU-GMs及CFUs數量較復蘇后(大袋)均有所降低，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.001，P<0.001，P=0.003，P=0.002)，而二者的CD34陽性細胞數基本相似，差異無統計學意義(P=0.245)，見表3。

表3 臍血復蘇后(小管)和復蘇后(大袋)的各項參數的比較

2.4 臍血復蘇后(小管)和復蘇后(大袋)的各項參數的相關性分析

復蘇后(小管)的總有核細胞數、細胞活率、CD34陽性細胞活率、CD34陽性細胞數、CFU-GMs及CFUs數量與復蘇后(大袋)的各相應參數均具有高度相關性(P<0.001)，見表4。復蘇后小管和復蘇后大袋的TNCs、CD34陽性細胞數、CFU-GMs和CFUs的相關性曲線見圖1。

表4 臍血復蘇后(小管)和復蘇后(大袋)的 各項參數的相關系數

3 討 論

隨著深低溫冷凍技術的發展和臨床臍血移植的廣泛開展，世界各地紛紛建立公共和自體臍帶血庫。據美國國家骨髓捐獻者計劃的統計數據，全球已有約54家機構可提供超過802 000份臍帶血，完成超過50 000例臍帶血移植[6- 7]。臍血的平均使用率不到10%，隨著時間的推移，越來越多的臍血將處于長期凍存狀態，面臨著細胞活力丟失、環境溫度失控、人為操作失誤等風險。因此，臍血庫應建立嚴格完善的質控體系，定期評估臍帶血的質量和性能，及時發現并清除不合格產品。

含有臍帶血終產品的冷凍袋在封口前保留一段附屬連接小管，通過熱合機隔斷為數段，可作為長期凍存臍帶血的質控樣本。小管與大袋連接，一同存放于鋁夾內，避免了樣本混淆。

本臍血庫從2009年起對入庫的樣本保留了與血袋相連的備份小管。本研究選取2009年3月—2021年2月在廣州臍血庫凍存的53份臍帶血樣本為研究對象，分為冷凍前、小管復蘇和大袋復蘇三組。臨床實踐表明，臍血輸注劑量與植入及造血重建速度密切相關，而無論是冷凍前還是復溫后的CD34陽性細胞數量、CFUs數量比TNCs與移植效果的相關性更為密切[8-10]，因此，我們評價了各組樣本的TNCs、細胞活率、CD34陽性細胞數量、CFU-GMs、CFUs等質量參數。結果顯示，小管復蘇后TNCs數量、細胞活率、CFU-GMs數量及CFUs數量均低于冷凍前，而二者的CD34陽性細胞數量相當；大袋復蘇后TNCs數量、細胞活率亦低于冷凍前， CFUs數量略高于冷凍前，但 CD34陽性細胞數量及CFU-GMs數量相當；小管復蘇后的TNCs數量、細胞活率、CD34陽性細胞活率、CFU-GMs數量及CFUs數量均低于大袋復蘇后，而二者的CD34陽性細胞數量相當。同時，小管復蘇與大袋復蘇后的TNCs數量、細胞活率、CD34陽性細胞活率、CD34陽性細胞數量、CFU-GMs數量及CFUs數量均存在高度相關性。

圖1 臍血復蘇后小管和復蘇后大袋的TNCs、CD34陽性細胞數、CFU-GMs和CFUs的相關性曲線注：A：復蘇后小管和大袋的TNCs相關分析曲線(n=53, Y=1X+0.12, R2=0.948) B：復蘇后小管和大袋的CD34陽性細胞數相關分析曲線(n=36, Y=0.56X+2.11, R2=0.577) C：復蘇后小管和大袋的CFU-GMs相關分析曲線(n=28, Y=0.54X+3.93, R2=0.612) D：復蘇后小管和大袋的CFUs相關分析曲線(n=28,Y=0.54X+10.9, R2=0.704)

理論上，小管與大袋共同經歷了臍血制備、程序降溫到長期凍存的全過程，其復蘇后的檢測指標應接近，但文獻報道的結果卻不盡相同[11-17]。van Haute等[13]發現，附屬小管的CD34陽性細胞比大袋高15%，而同時備份的0.5 mL凍存管中的CD34陽性細胞數與大袋接近，他們認為除附屬小管外，臍血庫應保留更多的凍存管備份樣本，并提供給移植中心自行檢測，以獲得更為準確的輸注劑量。Lee[15]等發現，附屬小管的活率、CD34陽性細胞、CFU-GM和CFUs 均高于大袋，推測可能是小管的管徑厚度均勻，有利于細胞活性的維持。他們發現小管和大袋的各相應指標之間存在高度相關性，認為小管的檢測結果可以代表大袋中臍血的質量，并可通過回歸方程推算大袋的細胞數量，供臨床移植參考。但Faivre[16]等發現，復蘇后小管的細胞活率低于大袋，認為可能是二者的體積和容量不同，造成冷凍時溫度差異，導致細胞活力受損；小管的檢測結果不能預測大袋中臍血質量的好壞，甚至可能導致合格的臍血被召回，使患者失去治療的機會。他們建議應更加關注冷凍前數據，并強調臍血庫應該接受權威機構認證，保證臍血制備和凍存的質量。Galindo[17]等發現，復蘇后近端和遠端小管的細胞活率和集落增殖效率與大袋接近，但中段小管低于大袋，推測可能是由于中段小管在冷凍過程中接觸到大袋表面不規則突起(如接口處或凹痕)導致活率降低。本研究發現，低溫凍存和復蘇過程會降低臍帶血的TNCs及細胞活率，但CD34陽性細胞數量相當，各觀察指標間均存在高度相關性，因此，附屬小管可作為臍血庫質量控制和樣本發放前復核的取材。

本研究的臍血均為內部質控樣本，所有檢測在本實驗室完成。我們未將移植供體納入分組，是考慮到臍血已發往臨床，只能在當地實驗室檢測，存在取樣和操作誤差，但也導致本研究缺乏臨床數據。另外，總體例數偏少，各組間樣本數不平衡(主要是部分樣本取樣量不足，無法檢測)是本研究的另一局限。值得注意的是，雖然各組的CD34陽性細胞數量相當，但造血集落的生長卻存在差異，復蘇后大袋略高于冷凍前，而復蘇后小管又低于冷凍前和復蘇后大袋，表明CD34陽性細胞數量的多少并不意味著造血功能是否完好，這也從Morgenstern等[18]和Brand等[19]的報道中得到證實。

總之，臍帶血作為一種既可長期凍存，又能隨時回輸的干細胞治療產品，其產品質量應備受關注。臍血庫應依照國內外最新行業標準，不斷修訂和完善質量控制體系，細化臍血處理、凍存、復溫等關鍵步驟的操作規程，確保臨床移植用血的安全。