體外消化和結腸發酵對蜂花粉酚類化合物及抗氧化活性的影響

王小超，程妮,2*，段倩倩，趙丞，徐元元，陳思南，曹煒,2

1(西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安，710069)2(陜西省蜂產品工程技術研究中心，陜西 西安，710065)

蜂花粉是蜜蜂通過采集顯花植物的花粉，并添加花蜜等物質后形成的顆粒物，富含多酚、纖維素等物質，在我國作為保健食品已有幾百年的歷史。蜂花粉中的酚類化合物可以清除自由基，從而改善氧化應激對機體造成的危害，如炎癥、心血管疾病和癌癥等，因此蜂花粉多酚的吸收和利用與人體的健康息息相關[1]。

生物有效性指數是用來評估從食物中釋放出來可以被人體吸收的化合物的量[2]，因此要提高多酚在體內的利用率就必須提高其生物有效性。根據溶解度可將多酚分為兩類：通過有機溶劑提取的可溶性游離態多酚，和保留在剩余殘渣中的不可溶鍵合態多酚。膳食攝入的游離態多酚不到膳食總酚的10%，大部分鍵合多酚以共價鍵結合在細胞壁結構成分上，不能被胃和小腸消化，只有在腸道微生物作用下才能從食物基質中釋放出來，從而被人體吸收利用[3]。另一方面，花粉粒外壁較厚，而且對酸、堿等理化因素有一定的耐受性，因此不利于多酚等營養物質的釋放。有研究表明，通過某些微生物對蜂花粉進行發酵，不僅能達到破壁的目的，還能促進營養物質的釋放，提高其生物有效性[4]。因此，腸道微生物對蜂花粉的作用可能是蜂花粉在體內發揮生物學功效的關鍵環節，但目前尚未有這方面的研究。

體外消化和結腸發酵模型廣泛應用于研究食物和藥物在體內的吸收和利用情況，與體內模型相比，體外實驗不僅沒有道德爭議，而且重現性高、簡便易行，能夠更加客觀系統地評估營養物質在體內各個階段的生物有效性[5]。體外消化一般是指胃和腸消化，該過程模擬了體內生理條件，如消化時間、溫度、pH值、酶的種類及其濃度、鹽濃度等[6]，這些條件均會對營養物質產生影響。體外結腸發酵一般是利用人類糞菌對體外消化后的殘余物進行發酵，促進營養物質從食物基質中釋放，提高營養物質的生物有效性。許多研究者通過體外模型研究食物基質中酚類化合物的生物有效性，發現角豆粉[7]、堅果[8]經結腸發酵后，其抗氧化活性以及生物有效性得到較大提高。蜂花粉中含有豐富的酚類物質，如山奈酚、柚皮素、沒食子酸等[9]，但目前尚未有文獻通過體外模型研究不同蜂花粉酚類化合物的生物有效性。因此，本研究以油菜蜂花粉、茶花粉、五味子蜂花粉為原料，研究3種蜂花粉在不同消化階段以及發酵時間總酚、總黃酮和抗氧化活性的變化規律，并進一步分析其生物有效性，為開發新型蜂花粉功能食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉、五味子蜂花粉、茶花粉均購自蜂農處，并通過孢粉學鑒定植物源[10]，以確定3種蜂花粉的種類。

α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽，上海阿拉丁生化科技有限公司；DPPH、沒食子酸、福林酚、FeSO4·7H2O、CaCl2·6H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2、CuSO4·5H2O 等，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

200T粉磨機，永康市鉑歐五金制品有限公司；NDK200-1氮吹儀，上海皓莊儀器有限公司；CXG-1微生物培養箱，上海青浦滬西儀器廠；UV1800分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司制造；52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C實驗室pH計，上海佑科儀器有限公司；SHA-B恒溫搖床，常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

將油菜蜂花粉、五味子蜂花粉、茶花粉除雜，磨粉過50目篩，密封貯存于-20 ℃。

1.3.2 蜂花粉總可溶酚類化合物的提取

參照陳壁等[11]的方法，分別稱取2.4 g 3種蜂花粉粉末，用70%(體積分數)丙酮超聲提取20 min后離心，取上清液，即為總可溶多酚化合物。

1.3.3 體外模擬胃腸消化

參照GULLON等[12]的方法，先進行胃消化，再將胃消化后的殘余物進行腸消化。用1 mmol/L CaCl2配制的100 U/mL α-淀粉酶溶液，用5 mL 0.1 mol/L HCl溶解0.06 g胃蛋白酶配制胃消化液；用5 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液溶解250 mg膽鹽配制膽汁溶液，用5 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液溶解0.04 g胰蛋白酶并與1.2 mL膽汁溶液混勻配制腸消化液。

模擬胃消化：分別稱取2.4 g 3種蜂花粉粉末，依次加入1 ml配制好的α-淀粉酶溶液、9 mL蒸餾水，混合均勻后，于37 ℃恒溫振搖2 min。然后用6 mol/L HCl將3種蜂花粉懸液調至pH 2，分別與1 mL模擬胃液混合均勻，于37 ℃恒溫振搖消化2 h。模擬胃腸消化：用6 mol/L NaOH將3種蜂花粉胃消化后的懸濁液調至pH 7，分別加入2.4 mL模擬腸液混合均勻，于37 ℃恒溫振搖消化2 h。模擬小腸吸收：將模擬體外消化結束后的3種蜂花粉懸濁液于37 ℃，10 mmol/L NaCl 溶液中透析過夜(3 kDa)。

1.3.4 體外模擬結腸發酵

選擇3名3個月內未服用過任何抗生素的健康成年人作為新鮮糞便提供者，糞便樣品以質量比1∶1∶1混合，依據MOSELE等[13]的方法配制腸道發酵菌液，貯存于-20 ℃備用，37 ℃恒溫解凍后使用。其中發酵菌液的配制要在1 h內完成。參考LEBET等[14]方法配制體外發酵培養液。將經過模擬體外消化和小腸吸收后的殘余物與體外發酵培養液、腸道發酵菌液以1∶2∶2的比例混合均勻，充氮氣4 h，在37 ℃厭氧條件下分別培養0、3、6、12、24 h。

1.3.5 多酚提取以及生物有效性

收集體外消化以及結腸發酵各個階段的上清液，用乙酸乙酯萃取后真空旋干，甲醇定溶，于-20 ℃冰箱貯存，用于測定各項指標，并按照公式(1)計算生物有效性：

(1)

式中：PCA(polyphenolic compounds content in samples afterinvitrodigestion or colonic fermentation)：不同體外消化階段或不同結腸發酵時間樣品中酚類物質的量；PCB(polyphenolic compounds content in samples beforeinvitrodigestion)：體外消化之前樣品中酚類物質的量。

1.3.6 總酚含量測定

總酚含量測定參考BOUAYED等[15]的方法，以沒食子酸(gallic acid equivalents，GAE)為標準品繪制標準曲線，所得結果用沒食子酸當量來表示，結果表示為mg GAE/g樣品。

1.3.7 總黃酮含量測定

總黃酮含量測定參考BLASA等[16]的方法，以蘆丁為標準品繪制標準曲線，所得結果用蘆丁當量(rutin equivalents，RE)表示，結果表示為mg RE/g樣品。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測定

參考JAYAPRAKASHA等[17]的方法并經適當修改，利用維生素C繪制標準曲線，取適量樣品溶液與4 mL 0.04 mg/mL DPPH的甲醇溶液充分混合后，避光反應并測定吸光度，DPPH自由基清除能力以每克樣品中相當于維生素C的物質的量表示，單位為mg維生素C/g樣品。

1.3.9 鐵離子還原力測定

參考ULUSOY等[18]的方法并經適當修改。取適量樣品溶液與4 mL 2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4, 6-tripyridyl triazine，TPTZ)工作液混合，于37 ℃水浴10 min，在593 nm處測定吸光度。結果表示為mg Trolox/g樣品。

1.3.10 亞鐵離子絡合力測定

參考SINGH等[19]的方法對樣品的亞鐵離子絡合能力進行了測定。取適量樣品溶液與100 μL 1 mmol/L FeSO4、300 mL 1 mmol/L鐵試劑混合，用甲醇定容至1 mL，在562 nm處測量吸光度。結果以每克樣品相當于乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA)的質量來表示，單位為mg Na2EDTA/g樣品。

1.4 數據統計分析

所有實驗結果均測定3次，結果表示為平均值±標準偏差。通過SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和Tukey多重比較，對數據進行顯著性差異分析(P<0.05)；運用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 體外模擬消化過程中3種蜂花粉酚類化合物含量及其抗氧化活性

蜂花粉的抗氧化活性與酚類化合物的含量有關，其抗氧化活性可能會因胃腸消化過程中的環境不同而發生變化[20]。另外，由于食品的抗氧化活性是由多種反應機理決定的，因此本文結合多種方法來測定蜂花粉體外消化各階段的抗氧化能力。由表1可以看出，3種蜂花粉未消化階段的總酚、總黃酮含量均高于體外消化階段，這可能是由于體外消化階段測定的是消化后樣品的上清液，而未消化階段測定的是蜂花粉樣品的總可溶性多酚。SHU等[21]在研究茶粉多酚的體外消化特性時發現，未消化比消化過的樣品呈現出更高的抗氧化活性，該研究與本實驗結果相似。ARGYRI等[22]發現酚酸、類黃酮等酚類化合物的溶解性和可利用性受到pH條件以及與膳食成分(如鐵、纖維或蛋白質)相互作用的影響。經過體外消化后，蜂花粉中酚類化合物在酸堿環境和消化酶作用下從基質中釋放出來。由表1可知，茶花粉的多酚溶出量最多，在胃消化和胃腸消化結束后酚類物質的含量分別是2.76、2.69 mg/g。這可能是茶花粉中可溶性游離態酚類化合物含量較高，易于溶出，而五味子蜂花粉、茶花粉中不可溶性結合態酚類化合物含量較高，對胃腸消化液的抵抗力較強。與胃消化相比，3種蜂花粉經過模擬胃腸消化后酚類化合物的含量均降低。這一結果與鄭慧等[23]研究一致，蜂花粉經模擬胃腸消化后酚類物質的含量降低，這可能是由于腸道的溶解氧和堿性環境引起了兒茶素等酚類物質的自氧化[24]。事實上，在胃腸消化條件下不同酚類化合物的穩定性不同。李俶等[25]研究了體外模擬消化對7種酚類物質穩定性的影響，結果發現經過胃消化后兒茶素和表兒茶素的含量分別降低了16.6%和6%；經過胃腸消化后，只有阿魏酸的含量略有上升，其余酚類化合物的含量均呈降低趨勢，其中沒食子酸下降了71%，綠原酸下降了35%。有研究顯示，油菜蜂花粉、五味子蜂花粉、茶花粉均含有豐富的沒食子酸、對羥基苯甲酸、鞣花酸等酚類化合物[9]，這可能是3種蜂花粉多酚在胃腸消化階段不穩定的原因。

表1 體外消化后蜂花粉中酚類化合物含量以及抗氧化活性 單位：mg/g

2.2 體外結腸發酵過程中3種蜂花粉酚類化合物和抗氧化活性

由圖1可知，在模擬體外結腸發酵過程中，隨發酵時間的延長，3種蜂花粉中總酚和總黃酮含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)。結腸發酵24 h時，3種蜂花粉的總酚含量分別達到5.99、7.17、6.38 mg/g，總黃酮含量分別達到4.27、4.62、3.68 mg/g；與發酵0 h相比，3種蜂花粉的總酚含量分別提高了67.75%、70.11%、75.31%，總黃酮含量分別提高74.55%、80.96%、78.52%，其中五味子蜂花粉在體外結腸發酵過程中釋放的酚類物質最多。這可能是由于在結腸微生物發酵的過程中，蜂花粉中的鍵合態多酚與細胞壁成分相連接的共價鍵、氫鍵和疏水鍵在微生物和酶的作用下發生斷裂，這些多酚以可溶性游離態的形式釋放出來，導致酚類化合物的含量提高[26]。DONG等[27]研究發現，與體外消化相比，結腸發酵顯著釋放并轉化了大量胡蘿卜結合態多酚，微生物途徑可能是對羥基苯甲酸、阿魏酸、沒食子酸和原兒茶酸等26種酚類物質釋放及代謝的主要途徑。除此以外，結腸發酵過程中酚類化合物含量的增加可能還與微生物發酵促進蜂花粉破壁有關。有研究發現，乳酸菌、酵母菌、植物乳桿菌、保加利亞桿菌等均可以通過發酵作用使蜂花粉破壁，并促進營養物質的釋放[4]。

a-多酚含量；b-黃酮含量圖1 體外結腸發酵后蜂花粉中總酚和總黃酮的含量Fig.1 The total phenolic content and total flavonoids content of bee pollen after colonic fermentation in vitro注：圖中相同樣品肩標不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

由圖2可以看出，在體外結腸發酵的24 h過程中，3種蜂花粉的鐵離子還原力、亞鐵離子絡合力、DPPH自由基清除力均呈逐漸增加的趨勢，這與3種蜂花粉在發酵過程中酚類化合物含量增加有關。結腸發酵24 h時，與發酵0 h相比，3種蜂花粉的鐵離子還原力分別提高了49.38%、59.31%、60.91%；3種蜂花粉對亞鐵離子的絡合力分別提高了69.33%、71.69%、84.93%；3種蜂花粉的DPPH自由基清除能力分別提高了69.47%、73.57%、68.57%。研究發現，對青稞進行體外結腸發酵前30 h內，酚類化合物含量與抗氧化活性顯著升高[28]，巴西莓的抗氧化活性在體外結腸發酵過程中也呈逐漸升高的趨勢[29]，這與我們的研究結果一致。胃腸系統由于經常暴露于活性氧(reactive oxygen species，ROS)和源于飲食的病原體自由基中，從而發生過度氧化應激反應[30]，膳食攝入的多酚等抗氧化劑可以中和氧自由基，緩解由氧化應激引起的胃腸疾病。由圖2可知，與體外消化相比，結腸發酵顯著提高了3種蜂花粉的抗氧化能力，因此，腸道微生物對蜂花粉多酚的作用，可能是蜂花粉攝入后能夠緩解胃腸疾病的關鍵環節。

a-鐵離子還原力；b-亞鐵離子絡合力；c-DPPH自由基清除力圖2 體外結腸發酵后蜂花粉中酚類化合物的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activities of phenolic compounds in bee pollen after colonic fermentation in vitro

2.3 體外胃腸消化及結腸發酵過程中3種蜂花粉酚類化合的生物有效性

食物中多酚等生物活性物質含量的測定通常經過化學試劑提取后進行，但所有生物活性物質在體內發揮其生物學功效前都會受多種因素的影響，如食物基質、胃腸道的酸堿環境、酶、腸道微生物等，因此通過體外模型計算生物有效性才能更加客觀的評估人體實際利用的活性物質的量。由表2～表4可以看出，3種蜂花粉總酚、總黃酮以及抗氧化活性的生物有效性在體外消化和結腸微生物發酵過程中呈現先降低后上升的趨勢，其中在模擬小腸吸收后(發酵0 h)達到最低，在結腸發酵過程中逐漸升高。結腸發酵24 h時，3種蜂花粉多酚生物有效性均超過未消化時生物有效性，分別達到126.96%、139.74%、120.54%，與發酵0 h相比，分別提高了67.87%、73.01%、75.36%。實際上，存在于食物和草藥當中的天然酚類物質主要與糖和有機酸如奎尼酸結合，以縮合單寧等低聚物的形式存在。這些縮合物吸收不良或者根本不能被小腸吸收，需要在腸道微生物的作用下水解(脫糖基和酯水解)、裂解(碳環裂解；去脂化、去甲基化)和還原(脫羥基化和雙鍵還原)成更多生物可利用的小分子代謝物，從而提高生物利用率[31]。因此，為了提高蜂花粉多酚的生物利用率，可以通過體外益生菌發酵來輔助蜂花粉酚類物質的釋放。

表2 體外消化及結腸發酵后油菜蜂花粉中酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性 單位：%

表3 體外消化及結腸發酵后五味子蜂花粉中酚類化合物和抗氧化活性生物有效性 單位：%

表4 體外消化及結腸發酵后茶花粉中酚類化合物和抗氧化活性生物有效性 單位：%

3 結論

研究結果表明，3種蜂花粉經體外模擬胃腸消化后，多酚生物有效性分別達到47.16%、45.59%、50.75%，在體外結腸發酵24 h過程中，總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性顯著提高，多酚的生物有效性達到126.96%、139.74%、120.54%。這可能是由于蜂花粉中含有大量不可溶性鍵合態酚類物質，能抵抗胃腸消化液作用，而在結腸微生物的發酵作用下大量釋放。此外，不同種類蜂花粉在體外結腸發酵過程中多酚的釋放量不同，在3種蜂花粉中，五味子蜂花粉在結腸微生物發酵的作用下釋放的總酚、總黃酮的量最高，因此其抗氧化活性最高。研究結果表明，結腸發酵可以釋放鍵合態多酚以提高酚類化合物的生物有效性，是蜂花粉多酚在體內發揮作用的關鍵環節。該研究為開發蜂花粉抗氧化功能性食品提供理論依據。