黑靈芝多糖對糖尿病大鼠血糖血脂調(diào)節(jié)及腸道菌群的影響

吳睿婷，付王威，萬 敏，吳 偉，姚于飛，李文娟,*

（1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006）

隨著社會的迅速發(fā)展，高糖分高脂肪含量的飲食結(jié)構(gòu)已成為快節(jié)奏生活中常見的飲食模式，使得肥胖和糖尿病患者人數(shù)激增并呈現(xiàn)年輕化趨勢。目前，肥胖被公認是誘發(fā)2型糖尿病的獨立因素之一，在高糖高脂飲食長期誘導下形成高血糖高脂水平，導致胰島β細胞功能受損。同時，宿主飲食習慣的變化可直接導致宿主腸道微生物菌譜的改變，有研究顯示，腸道菌群和2型糖尿病之間存在一定聯(lián)系，腸道菌群失調(diào)可能參與到2型糖尿病發(fā)病機制中[1]。人體腸道內(nèi)寄居有數(shù)以百萬億計微生物，正常狀態(tài)下菌群間相互依存、制約、共生，形成相對穩(wěn)定的腸道微生態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，長期的高糖高脂飲食作用下，可能會打破這種微生態(tài)平衡，失調(diào)的腸道菌群會通過代謝、炎癥、免疫等途徑促進2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生[2]。Larsen等[3]通過對比糖尿病男性患者和正常男性間腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道內(nèi)厚壁菌門（Firmicutes）豐度減少，擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度增加，有益的共生菌如乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度降低。有文獻將這種改變與血糖和體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）比值的變化在糖尿病患者中存在普遍性，并且與血糖和BMI呈線性關(guān)系[4]。隨后腸道菌群被報道可以通過產(chǎn)生細菌素，抗生素和其代謝產(chǎn)物改變宿主的生理功能。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）主要由腸道微生物利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生，包括乙酸、丙酸和丁酸等，它們具有不同的生理功能，在多個器官和組織中發(fā)揮作用。研究證明SCFAs能通過調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素敏感性和宿主炎性內(nèi)環(huán)境來改善2型糖尿病[5]。

黑靈芝（Ganoderma atrum）作為藥食兩用的天然真菌，素有“仙草”之稱，是我國自古以來的傳統(tǒng)藥材和營養(yǎng)補充劑，含有多種活性物質(zhì)，如多糖、三萜類化合物、氨基酸多肽類等。Chen Yi等[6]通過熱水提法從黑靈芝中分離獲得了一種水溶性黑靈芝多糖（Ganoderma atrumpolysaccharides，PSG），并開展了大量的研究工作。本課題組前期研究表明，黑靈芝多糖是黑靈芝中最主要的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血糖和調(diào)節(jié)免疫功能等多方面的活性功能[7]。Li Lu等[8]發(fā)現(xiàn)黑靈芝多糖對鏈脲佐菌素（lipopolysaccharide，LPS）誘導的1型糖尿病小鼠胰腺損傷具有保護作用，可以通過降低血糖，抑制線粒體凋亡通路和激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路來降低胰島細胞凋亡。Zhu Kexue等[9]報道了黑靈芝多糖對2型糖尿病大鼠具有降血糖和降血脂的功能，同樣也減少了胰島細胞凋亡。基于以上研究，黑靈芝多糖已經(jīng)初步被證實具有抗糖尿病作用，但國內(nèi)關(guān)于黑靈芝多糖對糖尿病腸道菌群的影響研究鮮有報道。腸道部分微生物能選擇性利用飲食中的特定營養(yǎng)物質(zhì)促進自身的生長與富集，進而在宿主中發(fā)揮其有益或有害的作用。結(jié)合前期研究基礎[6-9]，黑靈芝多糖作為水溶性膳食纖維是否能被微生物選擇性利用進而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及其抗糖尿病的關(guān)聯(lián)仍需進一步研究。因此，本實驗建立大鼠糖尿病模型，引入高通量測序技術(shù)，旨在探究糖尿病發(fā)病機制與腸道微生物間的聯(lián)系，以及黑靈芝多糖作為食品對宿主腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，評估其對腸道菌群組成結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的影響，初步探討黑靈芝多糖抗糖尿病作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級Wistar雄性大鼠60 只（150～200 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2018-0003。大鼠飼養(yǎng)于干燥、通風、安靜的環(huán)境中，水和飼料無限供應。適應性喂養(yǎng)一周。高糖高脂飼料：66.5%（質(zhì)量分數(shù)，后同）基礎飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉。

黑靈芝（Ganoderma atrum）購自江西尋烏縣東江源珍稀食用菌廠，從黑靈芝菌種中分離得到黑靈芝多糖。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片 中美上海施貴寶制藥有限公司；10%中性福爾馬林固定液、無水乙醇、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰島素試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設備

血糖儀 德國Roche公司；3K15高速冷凍離心機美國Sigma公司；全波長多功能酶標儀 美國Thermo公司；超純水機 美國Millipore公司；組織脫水機、冷凍包埋機、轉(zhuǎn)式切片機、攤烤片機 金華科迪儀器設備有限公司；分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 黑靈芝多糖的制備

按照Chen Yi等[6]方法制備黑靈芝精制多糖，將黑靈芝子實體進行粉碎，體積分數(shù)95%乙醇溶液室溫下脫脂48 h，過濾；濾渣中加入蒸餾水，100 ℃下提取2 h，過濾、濃縮；將體積分數(shù)95%乙醇溶液加入濃縮液中至乙醇體積分數(shù)達到80%，4 ℃下沉淀多糖，醇沉后，4 000×g下離心20 min，加水復溶，Sevag法去除游離蛋白，透析、濃縮、凍干，得黑靈芝精多糖。

1.3.2 建立糖尿病大鼠模型

隨機分10 只作為正常對照組（control group，CN）飼喂普通飼料，其余50 只作為造模組，給予高糖高脂飼料，飼養(yǎng)8 周后禁食12 h。禁食結(jié)束后每千克體質(zhì)量大鼠進行尾靜脈注射含30 mg STZ的溶液，正常組大鼠尾靜脈注射等體積的檸檬酸緩沖液。72 h后用血糖儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）濃度，在造模后的第3、7天測得FBG濃度不小于11.1 mmol/L視為造模成功。剔除血糖不符合標準和造模死亡的大鼠，成模率約為67%。

1.3.3 動物分組、劑量設置及給藥方法

將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為以下6 組：模型組（diabetes mellitus group，DM）、陽性對照組（metformin group，MET）、黑靈芝多糖低劑量組（PSG low dose group，PSGL）、黑靈芝多糖中劑量組（PSG middle dose group，PSGM）、黑靈芝多糖高劑量組（PSG high dose group，PSGH）和CN組。黑靈芝多糖組和MET組分別采用黑靈芝多糖水溶液（25、50、100 mg/kgmb）與150 mg/kgmb二甲雙胍水溶液進行灌胃，CN組和DM組大鼠通過灌胃的方式給予相同體積的去離子水，灌胃劑量為0.2 mL/10 gmb，持續(xù)干預30 d。

1.3.4 FBG及胰島素水平測定

給藥前及給藥期間每周測定1 次FBG濃度，監(jiān)測各組FBG濃度，采血當天各組大鼠禁食（不禁水）12 h，以采血針刺破大鼠尾尖毛細血管采血，使用血糖儀測定大鼠FBG濃度。

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清胰島素水平，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。根據(jù)血清胰島素值計算大鼠胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR），如公式（1）所示。

1.3.5 血脂水平測定

收集血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL）水平。

1.3.6 腸道收集及形態(tài)病理學觀察

大鼠解剖后，迅速取出小腸組織，選擇約5 cm空腸，盡量避免如鑷子、剪刀使用不當?shù)热藶閾p壞行為，生理鹽水輕輕清洗后，使用干凈濾紙吸去水分，放入體積分數(shù)4%中性甲醛溶液固定24 h以上。隨后，將組織塊從固定液中取出，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片、貼片、脫蠟與復水，經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài)的變化。

1.3.7 盲腸內(nèi)容物的SCFAs濃度測定

參照實驗已建立的色譜分析條件和方法[10]，稱取適量乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸等標準品于100 mL容量瓶中，定容混勻，配制成梯度混合溶液。氣相色譜重復測定3 次，根據(jù)對應濃度的色譜圖，計算數(shù)據(jù)并繪制標準曲線。取大鼠結(jié)腸內(nèi)容物按1∶7（m/V）加入超純水，渦旋后超聲處理，然后置于冰浴中20 min，4 800×g離心20 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜后進氣相色譜分析，利用Hu Jielun等[10]的色譜方法測得對應SCFAs峰面積，根據(jù)標準曲線方程按公式（2）計算上清液中各SCFAs濃度。

1.3.8 16S rDNA高通量測序及微生物多樣性分析

收集大鼠糞便樣本，寄送至上海派森諾生物科技有限公司進行高通量測序文庫的構(gòu)建和Illumina MiSeq測序。通過基因組DNA抽提，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，熒光定量，Illumina PE250測序得到的DNA雙端測序讀段（pairedendsequencing reads，PE reads），采用DADA（divisive amplicon denosing algorithm）2方法進行降噪，拼接及去嵌合體，以100%相似度閾值進行分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，進一步采用Alpha多樣性分析（Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Faith_pd指數(shù)、Good’s coverage），Beta多樣性分析（主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）、非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析），分類學組成分析、物種差異性分析（韋恩圖、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）、LDA差異貢獻分析（LDA effect size，LEfSe）、隨機森林分析）等分析方法獲得微生物相關(guān)信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示，采用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，采用ANOVA法進行單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異，采用GraphPad prism 6.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑靈芝多糖對大鼠FBG濃度及胰島素水平的調(diào)節(jié)

HOMA-IR用于評價個體的胰島素抵抗水平，隨著胰島素抵抗水平升高而升高。由圖1可知，與CN組相比，糖尿病大鼠的FBG濃度顯著升高（P＜0.05），同時胰島素抵抗明顯。高糖高脂飲食能夠破壞部分胰腺組織，造成模型動物胰島素分泌相對不足，從而引發(fā)高血糖，高血糖能反饋性促進胰島素分泌，高脂飼養(yǎng)后造成模型大鼠胰島素抵抗，進一步加重高胰島素血癥。使用糖尿病傳統(tǒng)治療藥物二甲雙胍干預后，能顯著抑制糖尿病大鼠血糖濃度及胰島素抵抗水平的升高。與未經(jīng)處理的糖尿病DM組大鼠相比，灌胃黑靈芝多糖后的FBG濃度顯著降低（P＜0.05），同時HOMA-IR也顯著減小（P＜0.05），表明黑靈芝多糖能緩解糖尿病引發(fā)的大鼠血糖升高和胰島素抵抗，改善其胰島素敏感性。數(shù)據(jù)進一步顯示，在調(diào)節(jié)血糖水平和胰島素抵抗水平方面，PSGM組治療效果較優(yōu)于PSGL、PSGH組，并不呈現(xiàn)劑量依賴性，為后續(xù)選擇PSGM組研究多糖對腸道菌群的影響提供一定的數(shù)據(jù)支持。

圖1 黑靈芝多糖對糖尿病大鼠血糖和胰島素抵抗的影響Fig. 1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on FBG and insulin resistance in diabetic rats

2.2 黑靈芝多糖對大鼠脂代謝的影響

如表1所示，與CN組相比，DM組TC、TG和LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），而作為逆向轉(zhuǎn)運膽固醇到肝臟代謝的載體——HDL-C，其含量卻略高于正常組，但無顯著性差異，這可能由于血清中膽固醇含量增高使得HDL-C水平出現(xiàn)伴隨性增加，但其轉(zhuǎn)運速率遠不及膽固醇的攝入速率，從而導致膽固醇的累積。同時，與DM組相比，PSGL、PSGM、PSGH組的TC、TG、LDL-C水平均表現(xiàn)出下降趨勢，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，多糖劑量越高，干預效果越好，低、中、高劑量對這3 個指標都表現(xiàn)出顯著的改善作用（P＜0.05）；值得關(guān)注的是，在服用中劑量的黑靈芝多糖水溶液后，糖尿病大鼠血清中HDL-C水平進一步升高，與其他組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 黑靈芝多糖對大鼠脂代謝的影響Table 1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on lipid metabolism in rats

2.3 黑靈芝多糖對糖尿病大鼠腸道組織形態(tài)學的保護作用

腸道連接內(nèi)部和外部環(huán)境，不僅調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還具有免疫、生理和物理屏障功能。腸上皮作為腸道的重要組成部分，由絨毛和隱窩、上皮和內(nèi)皮細胞組成，能夠阻止外界不良因素的刺激和入侵，發(fā)揮物理屏障作用，腸道屏障可與其他屏障一起共同應對突然出現(xiàn)的應激。在本實驗中，對空腸組織進行HE染色，如圖2所示，CN組大鼠的空腸黏膜上皮細胞排列緊密，腸絨毛無明顯斷裂腫脹等癥狀，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；DM組部分小腸絨毛上皮斷裂脫落，隱窩深度明顯降低，形態(tài)結(jié)構(gòu)受到嚴重的破壞，間質(zhì)充血并有炎細胞浸潤；與DM組相比，多糖組和MET組空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)有所改善，絨毛增長，腫脹程度減輕，炎性細胞浸潤減少，表明黑靈芝多糖對糖尿病大鼠的腸道組織損傷有一定保護作用。

圖2 HE染色觀察腸道組織病理學變化（×40）Fig. 2 Histological change in intestine of rats (× 40)

2.4 黑靈芝多糖對大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs的影響

以上有關(guān)血糖水平與胰島素抵抗水平研究中，數(shù)據(jù)顯示PSGM組相關(guān)指標略優(yōu)于PSGH組，黑靈芝多糖在機體內(nèi)的有效作用與劑量之間沒有呈現(xiàn)預期的正相關(guān)依賴關(guān)系，結(jié)合其他實驗參數(shù)（脂質(zhì)代謝相關(guān)指標中PSGH組大鼠指標均優(yōu)于PSGM組大鼠），提示了黑靈芝多糖體內(nèi)作用模式較為復雜。大量研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)劑量-效應關(guān)系的作用方式一般呈現(xiàn)拋物線形式，通常隨著劑量的增加，效應或反應率的變化先迅速，之后相對緩慢，形成拋物線形狀。藥物效應強度是實驗劑量選擇的重要參數(shù)，是指能引起等效反應（一般采用50%效應量）的相對濃度或劑量，反映藥物與受體的親和力，其值越小則強度越大。藥物的最大效能與效應強度含意有本質(zhì)區(qū)別，二者并不平行。因此在同等活性功能（或差距接近）的情況下，選取劑量小的作為進一步研究，有利于探尋到更多的實驗可能。謝瑛[11]發(fā)現(xiàn)多糖的體內(nèi)作用模式呈現(xiàn)出一種非線性關(guān)系，且高劑量組未出現(xiàn)預期的最佳活性功能。因此本實驗選擇的PSGM組（50 mg/kgmb）進行盲腸內(nèi)容物中SCFAs和腸道微生物檢測分析。

腸道菌群參與機體生命活動的主要方式之一是產(chǎn)生SCFAs，SCFAs是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維的主要產(chǎn)物，還可以通過外源攝入獲取，其分子結(jié)構(gòu)小且不穩(wěn)定，主要包括了乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸6 種，其中乙酸、丙酸和丁酸約占所有SCFAs的95%以上[12]。本研究檢測了大鼠糞便樣本中以上6 種SCFAs濃度，組間變化如圖3所示，與CN組相比，DM組大鼠糞便中乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸濃度顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），丁酸濃度有降低趨勢；相反，丙酸濃度在DM組中極顯著升高（P＜0.01）。經(jīng)過二甲雙胍治療和黑靈芝多糖灌胃干預后，MET組和PSGM組大鼠糞便中丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸濃度相較于DM組有所增加，丙酸濃度極顯著降低（P＜0.01），與CN組無顯著性差異；PSGM組的異丁酸、戊酸和異戊酸3 種代謝產(chǎn)物濃度與DM組對比具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 黑靈芝多糖對短鏈脂肪酸的影響Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharide on intestinal SCFAs

不同SCFAs對糖尿病的影響存在差異，Sanna等[13]研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群產(chǎn)生的丁酸能調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，改善人體的胰島素抵抗；而糞便中丙酸鹽含量增加會提高2型糖尿病的患病風險[12]。然而，Lin等[14]給肥胖小鼠膳食中補充丁酸、丙酸和乙酸鹽，發(fā)現(xiàn)丁酸和丙酸可以通過減少攝入量預防飲食引起的肥胖和胰島素抵抗的作用。這些相關(guān)性的證據(jù)表明SCFAs積極參與到在糖尿病發(fā)展中。本實驗研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠糞便中丙酸濃度增加，與FBG濃度和HOMA-IR成正比，說明丙酸異常與糖尿病密切相關(guān)，但其在糖尿病中的作用還存在爭議，需要進一步研究。黑靈芝多糖抗糖尿病作用可能通過降低丙酸含量，促進丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸分泌，差異性調(diào)節(jié)SCFAs水平來發(fā)揮作用。

2.5 黑靈芝多糖對腸道菌群的物種多樣性及組成的影響

2.5.1 OTU數(shù)及Alpha多樣性分析

基于OTU數(shù)分別在門、綱、目、科、屬、種分類等級進行分析，不同分組的注釋情況如圖4所示。Venn圖結(jié)果顯示4 組重疊部分代表組間共有的OTUs，共655 個；DM組、MET組和PSGM組與CN組單獨重合OTU個數(shù)分別為244、384、637 個，說明黑靈芝多糖組與正常組OTU相似度高于DM組與正常組。

生態(tài)學中通常用Alpha多樣性來衡量個體內(nèi)菌群的多樣性，通過多個指標反映出生境下的物種豐富度、多樣性和均勻度等方面。腸道菌群的物種多樣性主要由Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Faith_pd指數(shù)和Good’s coverage反映。如圖4所示，DM組的Chao1、Faith_pd指數(shù)較CN組均有降低，MET組呈回升趨勢；Shannon指數(shù)組間無明顯變化。與DM組的糖尿病大鼠相比，黑靈芝多糖具有抑制腸道菌群豐富度下降的能力，使Chao1指數(shù)趨近于CN組；并能增加菌群的物種多樣性。總而言之，患有糖尿病的大鼠腸道微生物豐富度遭到破壞，導致腸道菌群失調(diào)，而黑靈芝多糖干預可以一定程度上平衡失調(diào)的腸道菌群。

圖4 大鼠腸道菌群Venn圖和Alpha多樣性指數(shù)Fig. 4 Venn diagram and alpha-diversity indexes of gut microbiota in mice

2.5.2 Beta多樣性分析

使用QIIME軟件計算Beta多樣性，通過分析Beta多樣性指數(shù)比較各組間微生物組成相似度。基于樣本中物種豐度信息進行PCoA，采用非加權(quán)UniFrac距離算法，結(jié)果如圖5A所示，CN組與DM組分開聚集，微生物群落的差異明顯，PC1為26.3%，PC2為15.4%。與DM組相比，多糖組微生物群落沿第一主坐標（PCo1）向CN組偏移，組內(nèi)中心連接點與正常組中心點的距離小于DM組與CN組的距離，在一定程度上能改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)分布；MET組沿著PC1和PC2遠離DM組，更接近CN組，能顯著改變腸道菌群的分布，改善腸道菌群失調(diào)。使用NMDS分析進一步驗證不同組之間的物種多樣性差異，結(jié)果如圖5B所示，CN組和DM組之間發(fā)生明顯的分離；多糖組組內(nèi)個體間雖然不明顯聚集，但都表現(xiàn)出偏離DM組向CN組靠近的趨勢，與DM組比較，其中心連接點與CN組間的距離縮短。以上結(jié)果表明DM組和CN組腸道微生物的物種組成存在顯著性差異，黑靈芝多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群物種結(jié)構(gòu)組成，減小由STZ誘導的糖尿病大鼠與正常大鼠腸道菌群物種組成間的差異。

圖5 Beta多樣性變化Fig. 5 Variation in Beta-diversity

2.5.3 腸道微生物菌落組成分析

通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫進行比對，對OTU進行物種分類，重點分析門水平和屬水平上大鼠菌群結(jié)構(gòu)組成。

圖6A為門水平上各組的物種組成分類柱狀聚類圖，大鼠腸道微生物主要由10 個門構(gòu)成，分別為Firmicutes、Bacteroidetes、變形桿菌（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、糖細菌門（TM7）、螺旋體門（Spirochaetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）。其中Firmicutes和Bacteroidetes均為優(yōu)勢菌門，是豐度最高的兩個菌門。比較組間豐度變化發(fā)現(xiàn)，由于STZ的干預，DM組較CN組的Firmicutes相對豐度顯著降低，而Bacteroidetes相對豐度明顯上升；相比于DM組，MET組和多糖組的Firmicutes相對豐度呈現(xiàn)不同程度的增加，Bacteroidetes相對豐度減少，說明黑靈芝多糖可以緩解由糖尿病引發(fā)的菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，但干預效果低于二甲雙胍。F/B可以在一定程度上作為反映腸道菌群紊亂的重要指標，并且與BMI和血糖有關(guān)。對比各組F/B平均值變化（圖6B），發(fā)現(xiàn)與CN組比較，DM組F/B平均值極顯著減小（P＜0.01），與血糖值呈負相關(guān)；MET組可以讓糖尿病大鼠菌群F/B恢復正常水平；多糖組相較于DM組，F(xiàn)/B平均值有一定程度的上升，與CN組相比沒有顯著性差異。

圖6C是各組在屬水平上分類學結(jié)果，乳酸菌（Lactobacillus）和普雷沃菌屬（Prevotella）在各組中均為優(yōu)勢菌屬；與CN組相比，DM組普雷沃菌屬（Prevotella）、布勞特氏菌屬（Blautia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、梭菌屬（Clostridium）和鏈球菌屬（Streptococcus）相對豐度增加；Lactobacillus、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、擬桿菌屬（Bacteroides）豐度明顯降低；與DM組比較，黑靈芝多糖灌胃后大鼠糞便中Prevotella、Blautia、Phascolarctobacterium、CF231的相對豐度降低，而Clostridium、糞球菌屬（Coprococcus）、Turicibacter、Bacteroides相對豐度增加；柯林斯氏菌屬（Collinsella）、Bifidobacterium、羅斯伯里氏菌屬（Roseburia）、Allobaculum主要出現(xiàn)在PSGM組和MET組中。

圖6 各組大鼠腸道微生物菌落組成Fig. 6 Composition of gut microbiota in mice from each group

2.5.4 門水平和屬水平組間差異物種分析

基于LEfSe篩選出CN、DM和PSGM組組間豐度差異顯著物種，柱長越長代表該分類單元的差異越顯著，本次實驗分析的LDA閾值為2.0。同時，應用隨機森林分類算法進行篩選，圖7分別為門分類水平和屬分類水平的評分結(jié)果。結(jié)合兩種分析方法，篩選出重要性評分高并且具有明顯組間差異物種，并選出DM組與PSGM組間具有顯著差異的物種，觀察其相對豐度變化情況。

圖7 大鼠腸道菌群組間差異顯著性分析Fig. 7 Significance analysis of differences in gut microbiota between groups

門水平上顯著差異物種相對豐度變化如圖8所示，DM組大鼠Firmicutes和Cyanobacteria的相對豐度極顯著降低，而Bacteroidetes的相對豐度要高于CN組。Cyanobacteria在腸道中占比較少，屬于革蘭氏陰性菌。Pandurangan等[15]通過STZ刺激大鼠建立糖尿病模型，使用Cyanobacteria灌胃進行干預，發(fā)現(xiàn)其可以降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，增加血漿胰島素，具有抗氧化、抗糖尿病作用。本實驗結(jié)果顯示，當灌胃黑靈芝多糖后，大鼠腸道內(nèi)的Cyanobacteria相對豐度極顯著增加（P＜0.01），與CN組無明顯差異。個體間腸道菌群組成往往存在著很大差異，然而在門水平上物種組成又呈現(xiàn)出相對穩(wěn)定的狀態(tài)，個體間差異主要表現(xiàn)在物種豐度變化。本實驗發(fā)現(xiàn)3 個差異物種，雖然Firmicutes、Bacteroidetes和Cyanobacteria中還包含了許多不同的菌屬，但認為其組間相對豐度變化可以看作一種趨勢性變化，具有代表性，可能與疾病以及多糖作用機制密切相關(guān)，并且從以往的研究中可以知道這種趨勢具有較好的重復性，易于比較和解讀。

圖8 大鼠腸道菌群組間門水平差異物種Fig. 8 Difference in gut microbiota between groups at phylum level

屬水平上顯著差異物種相對豐度變化如圖9所示，F(xiàn)irmicutes中Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira的相對豐度在糖尿病大鼠腸道中都表現(xiàn)出不同程度的下降，其中DM組的Lactobacillus和Oscillospira與CN組相比具有極顯著性差異（P＜0.01）。Bacteroidetes中Prevotella、CF231在DM組中富集，其中CF231未在CN組大鼠糞便內(nèi)檢出，Bifidobacterium相對豐度相比于CN組有所增加。黑靈芝多糖干預可顯著上調(diào)Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira、Bifidobacterium相對豐度，下調(diào)Prevotella、CF231相對豐度，使之趨于正常。并且檢測到Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira4 個菌屬在多糖組大鼠糞便中非常豐富，高于CN組和MET組。猜測這4 個菌種可能是黑靈芝多糖發(fā)揮其腸道調(diào)節(jié)功能的目標菌屬，雖然在腸道中所占比例較少，但個別物種豐度的變化可能是疾病治療的關(guān)鍵。

Bacteroidetes以產(chǎn)乙酸和丙酸為主，F(xiàn)irmicutes以產(chǎn)丁酸為主，其包含的Prevotella、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira都可將多糖發(fā)酵成SCFAs。糖尿病作為一慢性代謝性疾病，因持續(xù)的高血糖刺激，機體往往伴隨著復雜的慢性炎癥表現(xiàn)。前期研究結(jié)果顯示黑靈芝多糖的抗糖尿病作用與其抗炎作用相關(guān)[8,16]。有研究報道腸道內(nèi)擁有較高水平的Roseburia細菌的小鼠可以減少炎癥、動脈粥樣硬化患病風險及高血糖并發(fā)癥的危害，Roseburia是產(chǎn)丁酸的主力；Oscillospira通過降解利用多糖產(chǎn)生丁酸鹽參與炎癥預防[17-19]；而Prevotella主要分泌琥珀酸和乙酸，在有胰島素抵抗的妊娠期糖尿病女性腸道內(nèi)含量豐富，并且被證明與2型糖尿病胰島素抵抗增加有關(guān)，可能是2型糖尿病患者的腸道微生物中的特征菌[20-21]。本實驗結(jié)果也證明，在DM組中，Prevotella富集的同時大鼠胰島素抵抗情況加重。經(jīng)過黑靈芝多糖的治療，Prevotella豐度降低，血清胰島素抵抗水平降低。實驗結(jié)果說明黑靈芝多糖可以通過調(diào)節(jié)不同菌的豐度，緩解糖尿病癥狀，并且通過調(diào)節(jié)產(chǎn)酸菌的豐度來影響糖尿病大鼠糞便中SCFAs含量，對宿主發(fā)揮進一步的保護作用。

因此，黑靈芝多糖可能下調(diào)Bacteroidetes和Prevotella、CF231，通同時上調(diào)Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira、Bifidobacterium，進而調(diào)節(jié)不同SCFAs分泌來發(fā)揮治療作用。

圖9 大鼠腸道菌群組間屬水平差異物種Fig. 9 Difference in gut microbiota between groups at genus level

3 討 論

黑靈芝多糖是黑靈芝中水溶性膳食纖維組分，本實驗以黑靈芝菌蓋為原材料提取到靈芝多糖，其主要由核糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，按照0.20∶0.28∶1.00∶4.32∶2.21物質(zhì)的量比組成[22-23]。黑靈芝多糖被認為是黑靈芝的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及腸道保護等多種生理功能調(diào)節(jié)作用。基于黑靈芝多糖的降血糖功能，本實驗發(fā)現(xiàn)該多糖具有2型糖尿病保護作用，其作用機制與腸道菌群密切相關(guān)。

腸道細菌生態(tài)系統(tǒng)的改變可能導致代謝紊亂的發(fā)展，如2型糖尿病和肥胖癥。當長期攝入高糖高脂飲食，可能會改變腸道細菌特征和菌群結(jié)構(gòu)，導致SCFAs減少，有益菌降低，而脂多糖等內(nèi)毒素分泌增加并進入人體，從而參與炎癥、胰島素抵抗和與肥胖相關(guān)的2型糖尿病的發(fā)生[24-25]。本實驗預先采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8 周，造成胰島素抵抗，然后使用STZ尾靜脈注射誘發(fā)大鼠產(chǎn)生糖尿病。造模成功后，灌胃黑靈芝多糖水溶液干預大鼠糖尿病發(fā)展，檢測大鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)高通量測序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DM組和CN組之間Alpha多樣性和Beta多樣性有顯著性差異。糖尿病大鼠菌群豐富度明顯低于正常大鼠，PCoA顯示CN組大鼠表現(xiàn)出組內(nèi)聚集，個體間菌群組成相似；相反，糖尿病大鼠遠離CN組，個體間較為分散，菌群組成有差異；黑靈芝多糖能一定程度上調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)向CN組靠近，說明菌群失調(diào)是伴隨著糖尿病發(fā)生與發(fā)展的，并且個體間表現(xiàn)出很大差異性，黑靈芝多糖的干預能改善菌群失調(diào)的狀態(tài)。

接著從兩個方面去嘗試分析黑靈芝多糖對糖尿病大鼠腸道微生物改變的影響。第一，對菌群的物種結(jié)構(gòu)變化的影響。基于LEfSe分析和隨機森林分類算法篩選出兩個分類學水平上的差異菌群，門水平上Firmicutes、Bacteroidetes和Cyanobacteria豐度組間有顯著性差異，糖尿病大鼠中Firmicutes和Cyanobacteria豐度顯著降低。此外，本實驗計算了F/B，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM組的F/B比CN組低，多糖組有一定恢復，但無顯著性。根據(jù)資料顯示許多糖尿病研究中將F/B改變作為腸道菌群在肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的標志性變化，并與血糖水平和BMI有關(guān)[26]。此次實驗結(jié)果與前人研究結(jié)果[4]一致，但多糖組似乎沒有表現(xiàn)出很明顯的上調(diào)F/B的作用。

進一步在屬水平上篩選出了8 個菌屬，發(fā)現(xiàn)CF231是糖尿病大鼠中富集，在多糖組中豐度顯著降低。CF231是帕拉普氏菌科（Paraprevotellaceae）的一個屬，Yun等[27]研究發(fā)現(xiàn)CF231在超重患者腸道內(nèi)豐度增加，與BMI正相關(guān)。而Prevotella被報道發(fā)現(xiàn)與糖尿病胰島素抵抗增加有密切關(guān)系，并且Prevotella產(chǎn)生的琥珀酸通過一定合成路徑可以生成丙酸，這可能是導致DM組中丙酸異常增加原因之一，進而提高2型糖尿病患病風險[20-21,28]。由于丙酸在宿主中的作用是多樣的，其在2型糖尿病中的具體機制還需要進一步驗證和探究。

本實驗觀察到多糖組Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira的相對豐度顯著增加，Bifidobacterium在MET組中增加更為明顯。Lactobacillus和Bifidobacterium是人體腸道內(nèi)重要益生菌，具有降血糖、降血脂、預防腸道疾病等多種作用[29]。Bauer等[30]發(fā)現(xiàn)高脂飲食會降低乳酸菌的豐度，二甲雙胍可以通過增加乳酸桿菌的豐度，部分調(diào)節(jié)小腸菌群，影響腸道吸收葡萄糖的重要轉(zhuǎn)運蛋白從而控制血糖水平，這為黑靈芝上調(diào)乳酸菌豐度的作用機制提供思路。

第二，黑靈芝多糖對菌群代謝物的影響。膳食纖維經(jīng)過微生物的發(fā)酵降解產(chǎn)生具有一定生物活性的代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物由SCFAs、維生素、氣體等組成[31]。SCFAs部分由結(jié)腸上皮細胞吸收，部分通過血液進入體循環(huán)，在各組織中發(fā)揮作用。丁酸是腸上皮細胞的重要能量來源，同時在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、保持腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性等方面具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)丁酸對2型糖尿病的預防和治療有顯著貢獻，產(chǎn)生丁酸的細菌豐富度可能與2型糖尿病治療密切相關(guān)[32]。Roseburia是產(chǎn)生丁酸的主要貢獻菌，同時也是腸道膳食纖維的主要降解劑，膳食纖維木聚糖和甘露聚糖等可以通過Roseburia在腸道中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[33]。Coprococcus參與丁酸產(chǎn)生途徑包括磷酸/丁酸激酶途徑和丁酰輔酶A/乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移路線[19]。同時，Ruminococcus和Bifidobacterium是乙酸的主要產(chǎn)生菌。

總之，本研究表明，黑靈芝多糖對可通過維系大鼠腸道中微生物的結(jié)構(gòu)及SCFAs分泌水平的正常化，對STZ誘導的糖尿病大鼠血糖血脂和胰島素抵抗具有一定調(diào)控作用。黑靈芝多糖進入腸道后可以被腸道菌群利用，通過下調(diào)腸道微生物中的特征菌增加部分產(chǎn)酸菌的豐度，進而促進產(chǎn)酸菌SCFAs的分泌。

4 結(jié) 論

本實驗利用STZ尾靜脈注射的方法建立了大鼠2型糖尿病模型，探究了黑靈芝多糖對2型糖尿病大鼠血糖血脂的調(diào)節(jié)作用，以及對腸道菌群和其代謝產(chǎn)物SCFAs的影響。主要實驗結(jié)論如下：1）黑靈芝多糖可以顯著降低糖尿病大鼠血糖血脂水平，并減輕胰島素抵抗；2）黑靈芝多糖能夠通過改善糖尿病造成的腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，改變大鼠腸道微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，發(fā)揮腸道保護作用，黑靈芝多糖通過下調(diào)門水平Bacteroidetes和屬水平Prevotella、CF231相對豐度，同時上調(diào)門水平Firmicutes和Cyanobacteria，屬水平Lactobacillus、Roseburia、Oscillospira、Ruminococcus、Coprococcus、Bifidobacterium相對豐度，改善2型糖尿病大鼠腸道菌群失調(diào)；3）黑靈芝多糖可以差異性調(diào)節(jié)SCFAs含量，抑制丙酸含量異常升高，同時促進丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸分泌，這可能是通過調(diào)節(jié)相應產(chǎn)酸菌豐度實現(xiàn)的。以上結(jié)果說明黑靈芝多糖對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用可能是其發(fā)揮抗糖尿病作用的機制之一。