基于溶菌酶相轉變對聚乙烯包裝材料的抗菌生物改性

王 戰，付 星，董世建，李述剛,4,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；3.安徽榮達食品有限公司，安徽 廣德 242000；4.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

近年來，食品工業和消費者對食品加工、包裝和儲藏過程中食品的保鮮防腐越來越關注。食品包裝旨在通過保護食品不受環境影響，避免發生生化變化從而延長食品貨架期[1-4]。如何在延長食品貯存壽命、保證營養風味的同時最大化減少對環境的影響至關重要[5]。在眾多應用于食品包裝的聚合物中，聚乙烯（polyethylene，PE）由于其良好的性能和低廉的價格應用廣泛[6]。為了得到具有抗菌性的PE薄膜，可將PE薄膜與不同的活性物質，如天然抗氧化劑和抗菌劑等，復合制備食品抑菌保鮮膜。Cooksey提出有一種抗菌膜是將抗菌劑直接涂覆或吸附在包裝材料上[7]。如在PE膜表面涂覆殼聚糖[8]、明膠[9]等，使包裝膜具一定的有抗氧化性和抗菌性。Romani等采用魚的廢棄物提取蛋白，利用蛋白水解產物多肽改性PE膜，一方面充分利用了魚資源；另一方面改善了PE膜作為食品包裝材料的抗氧化性等性質[10]。

溶菌酶是一種胞壁質酶，可通過水解細胞壁中的糖苷鍵，導致細菌溶解死亡[11]。溶菌酶的來源廣泛，細菌、真菌、植物以及各種哺乳動物的組織中均可提取出溶菌酶[12-14]。在食品工業中，溶菌酶因對人體無毒性、無副作用而應用廣泛[15-16]。近年來，許多研究選擇將溶菌酶與多糖等其他活性物質進行復配，使溶菌酶更穩定，抗菌更高效，如酰化殼聚糖復合物[17]、植酸[18]、殼聚糖和納米纖維素[19]等，在活性物質與溶菌酶的協同增效作用下，溶菌酶的抗菌譜與應用范圍得到拓寬。劉琨毅等將溶菌酶與乳鐵蛋白復合制得的涂膜，能夠抑制耗牛肉中微生物的生長[20]。陳占祎等利用溶菌酶的凝膠特性，將其與原花青素和聚乙二醇復合得到水凝膠，與沒有添加原花青素的水凝膠相比，其強度、韌性和抗菌性能得到極大提升[21]。溶菌酶與還原劑作用可得到一種淀粉樣蛋白，該蛋白可通過自組裝在載體表面形成一層薄膜，且該薄膜具有良好的機械性、抗菌性[22]等。溶菌酶經三(2-羧乙基)膦（tris(2-carrboxyethyl)phosphine，TCEP）打斷二硫鍵后發生解折疊，三級結構及部分二級結構破壞，暴露疏水基團；疏水相互作用使解折疊溶菌酶分子聚集，從水溶態轉變為疏水態，這一轉變過程即為溶菌酶的相轉變[23]。Yang Peng等將溶菌酶與TCEP的混合液定義為相轉變溶液[23]。但該方法的研究應用主要集中在金屬材料方面，如對金屬鈦表面的改性，以改善其在骨移植[24]和藥物緩釋[25]領域的應用；對貴金屬如金離子進行回收，實現循環經濟[26]等。現階段對溶菌酶相轉變產物改性食品包裝材料的研究鮮見報道。

本實驗擬用PE膜為對象，研究溶菌酶在TCEP的作用下變性聚集所形成的涂層對PE膜的改性效果，重點對溶菌酶和TCEP的不同反應時間下產物的涂層微觀形貌、化學結構、元素組成、表面水相接觸角等進行表征，并研究溶菌酶相轉變類淀粉聚集體所形成的薄膜在不同條件下的穩定性以及對金黃色葡萄球菌的抑制作用。以期提高PE膜的抗菌性能，促進溶菌酶相轉變體系改性PE膜在食品包裝材料中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PE膜 佛山雙富包裝有限公司；溶菌酶、TCEP、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES） 美國Bio-sharp公司；金黃色葡萄球菌（CMCC(B)26003） 上海魯微科技有限公司；無水乙醇、甲醇等試劑均為國產分析純；實驗用水除特殊說明外均為去離子水。

1.2 儀器與設備

Nano ZS+MPT-2納米粒度及電位分析儀 英國Malvern公司；Nicolet IS-50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PHI 5000 VersaProbe III X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）儀高德英特（北京）科技有限公司；Empyrean銳影X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析儀 荷蘭帕納科儀器公司；SU-8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；OCA 15EC接觸角測量儀 德國Dataphysics公司。

1.3 方法

1.3.1 溶菌酶的相轉變

稱取一定量的HEPES溶于超純水配制10 mmol/L HEPES緩沖液，通過0.45 μm有機濾膜進行過濾。然后以該緩沖液為溶劑分別配制2 mg/mL的溶菌酶溶液和50 mmol/L的TCEP溶液，并使用5 mol/L NaOH溶液調節TCEP溶液至pH 7，4 ℃下保存備用。溶菌酶相轉變溶液為現配現用，將配制好的溶菌酶溶液和50 mmol/L TCEP溶液在室溫下等體積混合，振蕩15 s后即可得到溶菌酶相轉變溶液[24]。

1.3.2 PE膜的改性

將PE膜剪成1.0 cm×1.5 cm長方形片段，先后用無水甲醇、無水乙醇和超純水，分別在超聲條件下浸泡清洗10 min。隨后平鋪在潔凈器皿表面，晾干待用。然后取現配的溶菌酶相轉變溶液500 μL于處理后的PE膜上[27]，室溫下分別靜置20、60、120、180 min后，用HEPES緩沖液漂洗薄膜表面，采用氮氣吹干后置于干燥皿中備用，剩余溶菌酶相轉變溶液丟棄。以未經改性的PE膜為空白對照。

1.3.3 溶菌酶相轉變溶液粒徑測定

采用納米粒度及電位分析儀測定溶菌酶相轉變溶液的粒徑分布。取與PE膜反應不同時間的溶菌酶相轉變溶液進行測定。取1.5 mL樣品裝于比色池，平衡時間為1 min，散射角均為173°，測量溫度25 ℃，樣品折射率為1.43，分散劑折射率為1.33[27]。

1.3.4 PE膜的結構表征及性質測定

1.3.4.1 紅外光譜表征

取不同改性時間下的PE薄膜，測定其FTIR，解析PE涂層中的二級結構，重復3 次。將干燥后的不同改性時間下的PE膜剪裁成0.5 cm×1.0 cm長方形后，在4 000～400 cm－1范圍內對樣品進行128 次掃描，分辨率為4 cm－1[27]。

1.3.4.2 光電子能譜表征

利用XPS儀直接測定不同改性時間下的PE膜，對其進行定性分析。選擇單色器A1，能量為1 486.69 eV，功率為25 W，以能量為160 eV的恒定能量分析模式測試，設置C 1s結合能為284.8 eV，對樣品進行C、O、S、P、Cl 5 種元素的定性分析，判斷涂層的元素構成及官能團[28]。

1.3.4.3 X射線衍射表征

通過XRD分析儀對改性PE膜進行測試，X射線波長為0.154 nm，電壓45 kV，電流200 mA，衍射角度10°～60°，掃描速率為3（°）/min[29]。

1.3.4.4 SEM觀察

利用導電膠將不同改性時間的PE膜固定在樣品臺上，噴金30 s后，置于SEM下抽真空，加速電壓為30 kV，工作距離保持在1～5 mm，室溫下觀察同一樣品不同區域的微觀形貌，在不同放大倍數下對同一區域涂層微觀形貌進行觀察，調焦后拍照對比不同改性時間下PE膜的涂層形貌區別[29]。

1.3.4.5 水相接觸角測定

PE膜表面不同改性時間所形成的涂層水相接觸角由接觸角測量儀進行測定，添加800 μL的超純水于注射器中，打開光源和攝像頭，輕微旋轉接觸角測量儀上控制注射器的按鈕，緩慢滴加10 μL超純水至樣品表面，靜置15 s待樣品表面水滴不再移動后，停止錄像。選擇水滴穩定時圖像標注接觸角大小，保存數據。樣品均重復測定3 次，結果取平均值[26]。

1.3.4.6 穩定性評價

探究不同溫度、超聲條件、溶劑環境和離子強度下改性PE膜的穩定性。將處理120 min的改性PE膜樣品分別置于5、25、50、75 ℃下，2 h后取樣并按1.3.4.5節方法測定表面水相接觸角；樣品置于80、120、160 W和200 W的超聲功率下超聲10 min，隨后取樣并按1.3.4.5節方法測定水相接觸角；樣品置于pH 1.0（鹽酸溶液）、pH 12.0（氫氧化鈉溶液）的極性環境以及石油醚、三氯甲烷等有機溶劑中，浸泡2 h后，用超純水清洗樣品，待自然風干后，按1.3.4.5節方法測定樣品的水相接觸角；樣品分別置于濃度為50、100、150、200 mmol/L的氯化鈉溶液中，靜置2 h，待樣品自然風干后按1.3.4.5節方法對其進行水相接觸角測定[24]。

1.3.4.7 抗菌性評價

將金黃色葡萄球菌菌株在瓊脂培養基中于37 ℃下培養16 h，然后取過夜的菌懸液接種于新鮮培養基至OD600nm＝0.5，此時細菌濃度為5×108CFU/mL[28]。將PE膜紫外滅菌處理30 min。取濃度為5×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌100 μL接種到改性不同時間的PE膜上，于37 ℃生化培養箱中培養48 h后，用滅菌后的超純水清洗膜表面。取清洗液中存活的金黃色葡萄球菌稀釋后接種至平板上，置于37 ℃生化培養箱中培養36 h后，通過菌落計數法比較不同處理條件下金黃色葡萄球菌的生長情況[30-31]，以未經任何處理的接種組為空白組，測定未改性PE膜和改性PE膜處理組的菌落數。重復3 次，取平均值計算殺菌率。殺菌率按下公式計算。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均平行處理3 次，利用Origin 2017軟件進行數據分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 溶菌酶相轉變過程中的溶液粒徑變化

溶菌酶相轉變過程中混合溶液粒徑變化見圖1A。溶菌酶與TCEP反應5 min所得混合溶液的平均粒徑約為531.2 nm，當反應時間延長至10 min時，溶液平均粒徑增至955.4 nm，此時的溶菌酶相轉變聚集體在重力作用下沉降于PE膜表面，形成薄膜。溶液粒徑隨著反應的進行而不斷增大，60 min時達到2 305 nm。如圖1B所示，反應至60 min時，溶液的聚合物分散系數（polymer dispersity index，PDI）約為0.7，不同粒徑的顆粒聚集在混合液中，此時溶液體系分布逐漸混亂[32]。該現象與Wang Dehui等的發現一致，顆粒粒徑的增大是因為溶菌酶在TCEP的作用下解折疊暴露疏水基團，在疏水作用的驅動下聚集發生沉降，繼而溶液中交聯的聚集體顆粒粒徑逐漸變大[24]。

2.2 溶菌酶相轉變改性對PE膜結構的影響

2.2.1 FTIR分析

FTIR用以檢測涂層表面的功能性官能團種類以及官能團之間可能存在的相互作用類型[33]。如圖2所示，與空白對照的PE膜樣品相比，改性PE膜的FTIR存在明顯變化。改性20 min的樣品在1 650 cm－1附近有新的吸收峰，同時在2 360 cm－1處吸收峰加強，這種變化是由官能團C＝O、O—H、N—H伸縮振動所致，表明溶菌酶在TCEP的作用下，20 min內即可形成一定的相轉變涂層，且該涂層中共含有羧基、羥基、氨基等親水性功能基團；與空白對照相比，改性PE膜在1 000 cm－1附近的吸收峰消失，這是由于溶菌酶相轉變聚集體黏附在PE膜表面，覆蓋了空白膜自身對該波段光譜的反射，同時也說明PE膜表面成功附著溶菌酶相轉變涂層。隨著改性時間延長至60 min，PE膜在2 360 cm－1附近波段的振動更加明顯，但改性時間為120 min和180 min組的特征峰強度變化逐漸趨于穩定，說明溶菌酶與TCEP反應20 min即可在PE膜表面形成薄膜，該薄膜在60 min后逐漸趨于穩定。

圖2 不同改性時間下PE膜的FTIR圖Fig. 2 FTIR spectra of native and modified PE films at different reaction times

2.2.2 元素組成變化

XPS是一種通過測定光電子相對能量強度對元素含量進行定量分析的表征手段。以284.8 eV處的C 1s為內部參考[34]，得到寬譜圖（圖3A），對其中的N、C、O元素峰圖放大后得到圖3B～D。圖3A寬譜圖表明，未改性的PE膜表面僅一個特征峰，即PE膜主要由C元素組成，而改性PE膜表面出現至少4 個特征峰，其中由圖3B、D可知，與空白對照組相比，改性PE膜399、532 eV處峰強度增加，表明N元素、O元素含量大量增加，且由于TCEP中存在有微量的S元素（164 eV）、P元素（132 eV），所以改性PE膜在164 eV和132 eV處的峰強度也有所增加，表明PE膜表面覆有一層涂層，圖3C中特征C峰強度的變化亦論證了C元素含量的下降。涂層的主要元素組成為C（來源于溶菌酶）、N、O，以及少量的P、S。通過圖3B～D可以證明PE膜表面成功接枝上了活性基團，為薄膜表面的進一步修飾提供了活性位點[35]。

圖3 不同改性時間下PE膜的XPSFig. 3 XPS profiles of native and modified PE films at different reaction times

2.2.3 晶型結構與結晶度

如圖4所示，改性后的PE膜與空白PE膜相比，衍射峰位置一致，均在衍射角為22°和29°處有明顯的衍射峰，最強衍射峰均在22°處[36]。即溶菌酶相轉變改性不會改變PE膜晶型。不同改性時間下PE膜的衍射峰無明顯差別，說明隨著改性時間的延長，聚集體在PE膜表面的堆積不會影響薄膜自身的結構。結合XPS和FTIR結果可知，溶菌酶自組裝體對PE膜表面的黏附緣于溶菌酶分子中羧基、氨基等活性基團和自身的類淀粉樣蛋白結構這些活性成分在薄膜表面的疏水作用與表面相互作用，從而達成改性的目的，與薄膜自身內部結構無關[37]。

圖4 不同改性時間下PE膜表面的XRD圖Fig. 4 X-ray diffraction (XRD) spectra of native and coated PE films at different reaction times

2.2.4 微觀形貌

從圖5可以看出，20 min樣品膜表面某一處有致密的聚集體（蛋白質）聚集，其余區域顯示聚集體聚集較少。60 min改性樣品的聚集體分布較為均勻，但聚集體之間空隙較大，120 min改性后的PE膜中，聚集體較為均勻地分布在基底（PE膜）表面，且蛋白之間未出現過度融合。180 min改性樣品表面涂層分布致密均勻，但由5 000 倍放大圖可知，180 min改性條件下的溶菌酶相轉變聚集體之間發生較大程度的融合，即溶菌酶相轉變聚集體的形成時間越長，粒徑越大，相鄰顆粒更傾向于發生蛋白融合。當改性時間過長時，溶菌酶相轉變聚集體易在材料表面發生堆積，使得涂層不均勻，穩定性下降。改性時間為120 min時，涂層最為致密，且融合程度較低。這是因為在改性初期，PE膜與溶菌酶相轉變溶液之間的表面張力因布朗擴散運動而快速降低，使得納米顆粒能在界面之間實現動力平衡，完成自組裝[38-39]；隨著改性時間延長至120 min，此時聚集體數量增加，相轉變溶液表面張力降低速率逐漸緩慢，界面處趨于形成一張完整的薄膜而實現新的熱力學平衡，已吸附于界面的粒子阻礙連續相中的粒子繼續吸附至界面[37]。溶菌酶在TCEP的作用下在PE膜表面形成聚集體，該聚集體在表面張力及疏水性作用下形成一層致密的蛋白薄膜[24]。

圖5 不同改性時間下樣品的表面微觀形貌Fig. 5 Microstructure images of native and modified PE films at modification times

2.2.5 水相接觸角

材料表面的水相接觸角越小，親水性越好。由圖6可知，未經改性的PE膜水相接觸角大小為103°，改性后的PE膜的表面水相接觸角均在70°左右，表明溶菌酶相轉變形成的涂層對PE膜的疏水性有較大影響。未改性的PE膜表面呈疏水性，改性后的PE膜由于其表面的涂層富含羧基、羥基和氨基等親水性基團，故呈親水性[35]。不同改性時間下的PE膜表面的親水性差別不大，表明溶菌酶發生相轉變的速度極快，親水性薄膜可以在溶菌酶與TCEP接觸的20 min內基本形成，該結果與肉眼所觀察相轉變混合溶液的渾濁度變化現象一致。

圖6 不同改性時間下PE膜的水相接觸角Fig. 6 Water contact angle of native and modified PE films

2.3 溶菌酶相轉變改性對PE膜穩定性的影響

以未經改性的PE膜（對照1）和制備的改性時間為120 min的PE膜（對照2）為對照樣品，經不同處理的樣品表面水相接觸角分析結果如圖7所示。不同溫度、溶劑環境、離子強度以及超聲環境下的改性PE膜仍呈現出親水性。由圖7A可知，在不同溫度環境下，改性PE膜表面親水性變化不大，其中室溫（25 ℃）下的PE膜水相接觸角幾乎無變化；由圖7B可知，改性PE膜經極酸、極堿處理后未出現疏水情況，表明溶菌酶相轉變涂層不受強酸、強堿腐蝕，相較于酸性環境，堿性溶液處理后的改性PE膜親水性進一步增強，與新引入的—OH有關。同時，改性PE膜在石油醚、三氯甲烷等極性溶劑溶液中仍保持穩定，反映出薄膜涂層的抗蝕特性。由圖7C可知，經過NaCl溶液處理后的PE膜水相接觸角降低，是因為經不同濃度NaCl溶液處理的PE膜表面會附有一定的離子，這些離子易與水結合，進而使水相接觸角有所下降[40]。而水相接觸角低主要是因為涂層的黏附，所以不同離子強度不會影響涂層的黏附。由圖7D可知，不同超聲處理對溶菌酶相轉變涂層的黏附無明顯影響，PE膜仍表現出一定的親水性，且當超聲條件為160 W時薄膜的水相接觸角與未經超聲處理的PE膜接觸角差別最小。綜上所述，溶菌酶相轉變涂層可穩定地黏附在PE膜表面，不受溫度、超聲、離子強度和強酸強堿、極性溶劑的影響。由FTIR和XPS結果可知，薄膜在PE膜表面的穩定黏附是因為溶菌酶自組裝分子層在基底表面引入了活性官能團—NH2、—COOH、—OH、—SH。這些官能團通過靜電作用、疏水作用、氫鍵與界面相互作用[35]，從而使涂層能夠穩定黏附在基底表面。

圖7 不同溫度（A）、極性溶劑（B）、離子強度（C）和超聲功率（D）環境下樣品的水相接觸角Fig. 7 Water contact angle of different PE films under different conditions of temperatures (A), polar solvent (B), ion strength (C) and ultrasound power (D)

2.4 溶菌酶相轉變改性對PE膜抗菌性的影響

食品在包裝過程中極易受到葡萄球菌的污染，且細菌性食物中毒有很長的潛伏期，致死率較低[41]。金黃色葡萄球菌作為一種最常見的病原菌，將可能引起人體局部化膿感染，誘發肺炎等炎癥，嚴重時可導致敗血癥，是一種危險的對人體有極大危害的致病菌[42]。如圖8所示，未經任何處理的平板上金黃色葡萄球菌生長旺盛，然而經過PE膜處理的菌種生長受到一定的抑制作用，表明PE膜對金黃色葡萄球菌表現出一定的抑菌性，這可能是菌落在與PE膜接觸培養時缺少營養物質所致。經改性PE膜處理后的平板上金黃色葡萄球菌的生長明顯受到抑制，其中改性120 min的PE膜對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，平板上的菌落數最少。由菌落計數結果可知，溶菌酶溶液和PE膜均對金黃色葡萄球菌表現出一定的抑制作用，但當溶菌酶相轉變對PE膜改性后，其抑菌效果大大提高，改性PE膜對金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果。溶菌酶是通過水解細胞壁中肽聚糖主鏈上N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵起抑菌作用[43]。而改性后的溶菌酶相轉變涂層由于表面呈現豐富的凈正電荷與氨基，這些氨基提高了薄膜的表面抗菌能力[22,44]。有研究指出，相轉變后的溶菌酶能夠提高薄膜表面的凈正電荷[22]，可使微生物膜的靜電場發生紊亂，因而對革蘭氏陽性菌有較好的抑制能力。

圖8 不同改性條件下PE膜對金黃色葡萄球菌的抑制效果Fig. 8 Inhibitory activity of modified PE films toward Staphylococcus aureus

3 結 論

本實驗研究結果表明溶菌酶可被TCEP迅速還原，在基底表面形成蛋白質基涂層。且隨著反應時間的延長，涂層愈加均勻、致密。此外，水相接觸角、FTIR分析等結果表明，改性后的PE膜表面富含羥基、氨基等親水性活性基團，不同改性時間的涂層在不同溫度、離子強度、極性溶劑和超聲條件下均能穩定黏附在薄膜表面，且對金黃色葡萄球菌均表現出極佳的抗菌性能。本實驗可為蛋白質基改性PE材料在后續食品包裝領域的應用提供新的思路。但本實驗中的溶菌酶僅對革蘭氏陽性菌有明顯作用，為提高溶菌酶抑菌能力的廣譜性，仍需進一步研究。