HPLC-ELSD 和UPLC-MS/MS 法考察復(fù)方金銀花顆粒中金銀花投料規(guī)范性

王舒，姚奕然，黃賽燕，劉歡歡，徐丹洋，周謐

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 南通 226006

復(fù)方金銀花顆粒具有清熱解毒，涼血消腫的功效，用來治療風(fēng)熱感冒，喉痹，乳蛾，目痛，牙痛及癰腫瘡癤等病癥。該制劑是治療風(fēng)熱感冒的常用藥。復(fù)方金銀花顆粒由金銀花、連翹、黃芩三味中藥組成。其中金銀花的植物來源經(jīng)歷了多次變更，《中國藥典》2005 年版將金銀花和山銀花分列，規(guī)范了金銀花的來源，只收載了忍冬科植物忍冬一種來源；而收載的山銀花，來源為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬和黃褐毛忍冬［1］。

金銀花和山銀花為近緣植物，藥材的形態(tài)特征相似，但仍存在細(xì)微差別。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道金銀花和山銀花主要在化學(xué)成分、藥理研究方面存在差異。金銀花的體外抑菌效果優(yōu)于山銀花，高劑量山銀花提取物能夠引起大鼠的超敏反應(yīng)［2］。在中藥注射劑的應(yīng)用中，相比于金銀花，山銀花在發(fā)生溶血方面存在較大的隱患［3］。目前，《中國藥典》2020 年版中諸多含金銀花藥材的制劑對山銀花都進(jìn)行檢查，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不可檢出山銀花的主要成分灰氈毛忍冬皂苷乙。但由于金銀花藥材價(jià)格持續(xù)高漲，為降低生產(chǎn)成本，獲取更高的利潤，市場上存在著以山銀花摻入金銀花藥材進(jìn)行銷售的現(xiàn)象，部分廠家生產(chǎn)的金銀花制劑可能存在采用摻有山銀花的摻偽金銀花投料［4-9］。復(fù)方金銀花顆粒現(xiàn)行的法定標(biāo)準(zhǔn)中沒有相應(yīng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，無法有效地控制金銀花投料的規(guī)范性。

復(fù)方金銀花顆粒處方為使用金銀花投料，通過國家藥典委員會(huì)信息的查詢，無復(fù)方金銀花顆粒生產(chǎn)企業(yè)對處方提出變更，且標(biāo)準(zhǔn)中均未涉及對山銀花的檢查，對于生產(chǎn)中投入摻雜山銀花的行為未能起到有效的監(jiān)督。為提高復(fù)方金銀花顆粒的質(zhì)量控制水平，為藥品安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，本研究擬對市售復(fù)方金銀花顆粒的金銀花投料情況進(jìn)行考察，結(jié)合金銀花和山銀花所含主要成分的特點(diǎn)［10-12］，參考《中國藥典》2020 年版一部中銀黃顆粒［13］及國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法銀柴顆粒、小兒咽扁顆粒、清熱解毒口服液的山銀花檢查項(xiàng)，以灰氈毛忍冬皂苷乙作為山銀花的特征組分，采用高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLCELSD）法建立復(fù)方金銀花顆粒中摻雜山銀花的檢查方法，并建立超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）法，對HPLC-ELSD 法檢測陽性的樣品進(jìn)行確證，以評價(jià)該制劑中金銀花的投料規(guī)范性。

1 儀器與試藥

Dionex U3000 高效液相色譜儀配Thermo A2D蒸發(fā)光散射檢測器、U3000 Vanquish-ALTIS 超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國ThermoFisher 公司）；CPA225D 電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ-250E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Element 型超純水機(jī)（美國密理博公司）。

對照品：灰氈毛忍冬皂苷乙（純度：97.2%，批號(hào)：111814-202005），川續(xù)斷皂苷乙（純度：96.8%，批號(hào)：111813-201804）均購于中國食品藥品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)所用的復(fù)方金銀花顆粒樣品為在市場流通環(huán)節(jié)抽樣獲得，不同生產(chǎn)廠家共30 批次樣品，乙腈（德國默克，色譜純），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-ELSD 法

2.1.1 色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%乙酸溶液（B）；梯度洗脫程序：0～15 min，5% →20% A；15～30 min，20% →30% A；30～40 min，30% A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；蒸發(fā)光散射檢測器條件：漂移管溫度105 ℃，空氣流速：3.0 L/min。

2.1.2 供試品溶液取復(fù)方金銀花顆粒陽性樣品（檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的樣品，以下簡稱陽性樣品）（規(guī)格：每袋裝10 g，批號(hào)：531908）5 袋的內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取粉末5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理20 min（功率300 W，頻率50 kHz），取出放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液取金銀花藥材（經(jīng)鑒別為正品）、連翹藥材、黃芩藥材，按復(fù)方金銀花顆粒處方的制備方法進(jìn)行模擬工藝實(shí)驗(yàn)，制備陰性樣品。陰性樣品照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，制成陰性樣品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察分別精密量取“2.1.3”項(xiàng)下的對照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成每1 mL 約含灰氈毛忍冬皂苷乙20、50、100、200 和800 μg 的系列對照品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件依次進(jìn)樣，測定峰面積A，以系列對照品溶液進(jìn)樣量（μg）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（Log C），相對應(yīng)的峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)（Log A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算灰氈毛忍冬皂苷乙的回歸方程：Log A=1.594 2 Log C-2.258 3，r=0.999 3。結(jié)果表明，灰氈毛忍冬皂苷乙在0.39～15.74 μg 的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn)取灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液（濃度：49.183 2 μg/mL），照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件依次進(jìn)樣20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，以對照品峰面積A 為考察指標(biāo)，計(jì)算RSD 值為0.80%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)取復(fù)方金銀花顆粒陽性樣品（批號(hào)：531908），照“2.1.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，根據(jù)“2.1.5”項(xiàng)下的相應(yīng)回歸方程計(jì)算，平均含量為1.10 mg/g，RSD 為0.68%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn)取復(fù)方金銀花顆粒陽性樣品（批號(hào)：531908）的粉末9 份，每份5 g，精密稱定，分別置25 mL 量瓶中（共3 組，每組3 份），分別向每組精密加入濃度為1.960 3 mg/mL 的灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液2.0、3.0 和4.0 mL，照“2.1.2”中的方法平行制備9 份供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，根據(jù)“2.1.5”項(xiàng)下的相應(yīng)回歸方程計(jì)算回收率，結(jié)果表明平均回收率為97.35%，RSD 為2.26%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)考察結(jié)果（n=9）

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)在0、2、4、8、12、24 h 分別取同一份對照品溶液、同一份供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件進(jìn)樣測定，分別記錄兩種溶液中灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積，RSD 分別為1.34%和1.16%（n=6），表明對照品溶液、供試品溶液中主成分灰氈毛忍冬皂苷乙穩(wěn)定性良好。

2.1.10 專屬性試驗(yàn)將對照品溶液、依照處方自制樣品溶液（含5%山銀花）、供試品溶液（含灰氈毛忍冬皂苷乙的陽性樣品，批號(hào)：531908）、陰性樣品溶液（不含山銀花）和空白溶劑（50%甲醇），照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件測定，結(jié)果表明：采用灰氈毛忍冬皂苷乙作為區(qū)分金銀花和山銀花的特征組分是可行的；自制樣品和陽性樣品中均呈現(xiàn)與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，而陰性樣品中無相對應(yīng)的色譜峰，表明其他組分無干擾，方法專屬性良好。見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)的高效液相色譜圖

2.1.11 限度溶液取處方中金銀花用量按摻入1%、3%和5%山銀花投料，其余藥味按本品處方比例投料，按照工藝制法制成含不同比例山銀花的自制樣品，照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成含不同比例山銀花供試品溶液。

精密量取“2.1.3”項(xiàng)下的對照品溶液2 mL，置100 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得灰氈毛忍冬皂苷乙的限度溶液（定量限溶液：20 μg/mL）。

將上述溶液照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件測定，結(jié)果表明：摻入1%山銀花的供試品溶液中檢出灰氈毛忍冬皂苷乙（低于定量限）；摻有3%和5%山銀花的供試品溶液中均檢出灰氈毛忍冬皂苷乙；當(dāng)摻入3%山銀花時(shí)，所測得的峰面積與定量限相當(dāng)（S/N 約為10）。

2.1.12 判定原則供試品色譜中，在與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)的位置不得出現(xiàn)相同的色譜峰。若出現(xiàn)保留時(shí)間相同的色譜峰，且該色譜峰的峰面積值大于限度溶液（20 μg/mL）的峰面積值，則視為陽性檢出。

2.1.13 樣品測定取不同產(chǎn)地、不同廠家生產(chǎn)的共30 批金銀花顆粒樣品，照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，照“2.1.1”項(xiàng)下的方法條件測定，依據(jù)“2.1.11”項(xiàng)下的判定原則判定，其中有15 批樣品檢出灰氈毛忍冬皂苷乙（峰面積大于限度溶液的峰面積值），判定為陽性檢出。結(jié)果見表2。

表2 樣品中灰氈毛忍冬皂苷乙的測定結(jié)果

2.2 UPLC-MS/MS 法

2.2.1 UPLC-MS/MS 法色譜條件色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18 柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～1 min，90% A；1～7 min，90%→55% A；7～9 min，55%→5% A；9～10 min，5% A；10～12 min，5%→90%A；12～17 min，90% A；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。采用質(zhì)譜檢測器，電噴霧正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），離子化電壓：4 000 V；鞘氣：35 Arb；輔助氣：10 Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；蒸發(fā)溫度：300 ℃；選擇離子對（H+）：m/z1 399.8 →633.2 和m/z1 399.8 →795.2 作為灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測離子對。

2.2.2 溶液的制備精密量取“2.1.3”項(xiàng)下的對照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成1.0 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。精密量取HPLC-ELSD 法檢查呈陽性的供試品溶液，用50%甲醇稀釋為與對照品溶液濃度一致的溶液,作為供試品溶液。

2.2.3 樣品的測定精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的溶液和“2.1.4”項(xiàng)下的陰性樣品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件測定，結(jié)果表明：經(jīng)UPLC-MS/MS 法驗(yàn)證，HPLC-ELSD 法篩查出的15 批次呈陽性的樣品溶液提取離子流色譜圖中，均呈現(xiàn)與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液色譜相對應(yīng)的質(zhì)譜峰；而陰性樣品溶液的提取離子流色譜圖中，未呈現(xiàn)相對應(yīng)的質(zhì)譜峰。由此可見，建立的HPLC-ELSD 法可準(zhǔn)確檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，且與UPLC-MS/MS 法的驗(yàn)證結(jié)果一致。見圖2。

圖2 UPLC-MS/MS質(zhì)譜圖：A.對照品溶液；B.陽性樣品溶液；C.陰性樣品溶液

3 討論

3.1 特征組分的選擇

《中國藥典》2020 年版一部山銀花藥材的含量測定項(xiàng)下，以川續(xù)斷皂苷乙及灰氈毛忍冬皂苷乙作為山銀花的特征成分［13］。在建立本方法的研究過程中，考察過川續(xù)斷皂苷乙特征成分在復(fù)方金銀花顆粒中的檢測情況。本次檢出陽性的15 批次樣品中，只有7 批次檢出川續(xù)斷皂苷乙。另參考已發(fā)布的金銀花制劑銀柴顆粒、小兒咽扁顆粒、清熱解毒口服液等的山銀花檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，均選用灰氈毛忍冬皂苷乙作為山銀花的特征成分。基于上述原因，本方法亦選灰氈毛忍冬皂苷乙作為檢測指標(biāo)成分。

3.2 樣品提取溶劑和提取時(shí)間的選擇

試驗(yàn)過程中共考察了4 種溶劑：純化水、50%甲醇、70%甲醇和甲醇，分別超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）不同的時(shí)間（20 min、30 min 和45 min），結(jié)果表明：選擇50%甲醇為提取溶劑，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）20 min，灰氈毛忍冬皂苷乙的提取效率最優(yōu)。

3.3 限度溶液濃度的制定

考慮到不同品牌的設(shè)備靈敏度存在差異，當(dāng)樣品中的灰氈毛忍冬皂苷乙成分處于微量水平時(shí)，容易出現(xiàn)不同的判定結(jié)果。為避免上述情況的發(fā)生，本方法設(shè)定一定濃度的限度溶液，使用于檢測的儀器必須能夠檢出限度溶液。綜合考慮“2.1.11”項(xiàng)下液相驗(yàn)證的結(jié)果，摻入3%比例的山銀花的樣品與定量限（20 μg/mL）較為接近，故將方法的限度溶液濃度定為20 μg/mL，樣品的檢測結(jié)果統(tǒng)一與限度溶液進(jìn)行比對，從而保證檢測判定尺度一致。

3.4 制劑投料規(guī)范性評價(jià)

本實(shí)驗(yàn)研究建立的HPLC-ELSD 法和UPLCMS/MS 法都能夠準(zhǔn)確檢測出復(fù)方金銀花顆粒中的灰氈毛忍冬皂苷乙，有良好的兼容性，均可用于鑒別復(fù)方金銀花顆粒中山銀花替代金銀花投料。此外，HPLC-ELSD 法具有成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，而UPLC-MS/MS 法具有時(shí)間短、靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)。因此，對復(fù)方金銀花顆粒中山銀花替代金銀花的鑒別，可先用HPLC-ELSD 法進(jìn)行檢測，再進(jìn)一步采用UPLC-MS/MS 法進(jìn)行確證，避免假陽性的出現(xiàn)，彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對金銀花投料規(guī)范性監(jiān)測的盲點(diǎn)。

本次研究針對不同生產(chǎn)企業(yè)共30 批次的復(fù)方金銀花顆粒，按建立的HPLC-ELSD 法和UPLC-MS/MS法進(jìn)行檢驗(yàn)，15 批次樣品檢測出灰氈毛忍冬皂苷乙特征組分，不合格率為50%。結(jié)果表明，市售的該制劑品種中存在用摻有山銀花的摻偽金銀花進(jìn)行投料生產(chǎn)的現(xiàn)象。因此，有必要在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中增加山銀花檢查項(xiàng)，建立一種簡便、準(zhǔn)確、高效的方法測定山銀花專屬成分灰氈毛忍冬皂苷乙，加強(qiáng)對復(fù)方金銀花顆粒的有效監(jiān)督，以提高其質(zhì)量水平。