環磷酰胺對福建黃兔肝腎損傷的試驗研究

王 燕 周建華 俞春英 楊燕燕 謝金東 鐘秋明 王訓立

（福建中醫藥大學 福州 350122）

在臨床上，環磷酰胺作為抗腫瘤藥物，廣泛應用于惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、乳腺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤以及急性白血病和慢性淋巴細胞白血病等疾病的治療。 但過量使用時，會產生劑量依賴性的毒性臨床表現[1]。 環磷酰胺除了用于抗腫瘤藥物治療外， 也是常用的免疫抑制劑，因其價格低廉、效果良好而被廣泛應用[2]。環磷酰胺在體內代謝過程中， 不僅直接作用于細胞產生嚴重的毒性作用，還對肝臟、腎臟、胸腺、脾臟等器官有明顯的損傷， 人們也常常利用環磷酰胺的毒副作用，制備免疫抑制動物模型，獲得良好的免疫抑制效果，從而用于不同目的的科學探索試驗[3-4]。

本試驗采用福建特有的家兔品種福建黃兔作為試驗對象，通過注射不同劑量的環磷酰胺，觀察其對福建黃兔肝、腎造成的損傷程度，為用環磷酰胺制備福建黃兔動物免疫抑制模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 雌性福建黃兔18 只，體重2.0～2.4 kg，福建省連江玉華山自然生態農業試驗場提供。

1.2 主要試劑與儀器 環磷酰胺、分化液、返藍液購自上海源葉生物有限公司； 多聚甲醛購自蘭杰柯擴建有限公司； 滅菌生理鹽水購自福州海王福藥制藥有限公司； 酒精和二甲苯購自天津永大試劑有限公司；蘇木素染液、伊紅染液、中性樹膠由中杉金橋公司提供； 石蠟由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供（熔點 56～58 ℃）。

光學顯微鏡產自日本奧林巴斯公司 （型號：BX51T-PHD-J11）； 多功能真彩色細胞圖象分析管理系統由美國Media Cybernetics 公司提供 （型號：Image-Pro Plus）； 石蠟切片機為德國萊卡生產 （型號：RM2015）；電熱恒溫干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司（型號：DHG-9053A）；低溫冰箱由美國賽默飛世爾科技公司生產（型號：HFU586）；移液器購自德國EPPENDOR 公司；恒溫水浴箱由江蘇太倉醫用儀器廠生產（型號：DSHZ-300）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗動物及分組 18 只雌性福建黃兔飼養于普通級兔實驗室，自由采食和飲水，黃兔購進后在福建中醫藥大學實驗動物中心動物實驗室適應性喂養7 d，隨機分成6 組，分別為對照組和劑量組Ⅰ～Ⅴ， 每組3 只。 劑量組分別按環磷酰胺濃度20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg、100 mg/kg 腹腔注射，對照組腹腔注射滅菌生理鹽水2 mL。 連續給藥7 d，第8 d 解剖取材。 動物試驗期間，嚴格按照普通級實驗兔飼養管理標準操作規程。

1.3.2 試驗動物行為觀察 試驗給藥前和給藥結束后第2 d 分別對動物稱重。 試驗過程觀察動物的飲食、精神、外觀、行為等狀況。

1.3.3 樣品采集及預處理 采樣前12 h，動物禁食不禁水。 30%烏拉坦注射液（3.5 mL/kg 體重）耳靜脈麻醉黃兔，解剖摘取肝臟、腎臟組織，剔除組織表面脂肪和附著物，生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干，再修成3～5 mm3近方形組織塊， 置于4%多聚甲醛溶液固定，并在4 ℃保存備用。

1.3.4 石蠟切片制備流程 按常規石蠟切片制作技術，將樣品（肝臟、腎臟組織）放入包埋盒內，在自來水下沖洗1 h；使用梯度乙醇常規脫水，即用75%、80%、95%、95%、100%、100%乙醇分別處理 1 h，然后分別在二甲苯Ⅰ中處理25 min 和二甲苯Ⅱ中處理25 min；將樣品放入包埋模中，用石蠟封住，放入冷臺待其冷卻后取出； 取出包埋后的蠟塊， 切片機切成 4～5 μm 厚的蠟片， 烘烤切片， 用二甲苯脫蠟處理。

1.3.5 H.E 染色操作流程 石蠟切片二甲苯脫蠟10 ～30 min → 無 水 乙 醇 Ⅰ 5 min → 無 水 乙 醇 Ⅱ5 min→95%乙醇Ⅰ 5 min、 Ⅱ 5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→水洗1 min→Harris 蘇木素液1～3 min→水洗→0.5%鹽酸酒精分化液分化3～10 s→水洗→返藍液反藍5～10 min （注意觀察顏色變化）→水洗1～3 min→伊紅染液 3～5 min→95%乙醇Ⅰ 1 min、 Ⅱ 5 min →無水乙醇Ⅰ 5 min、Ⅱ5 min→二甲苯透明20～30 min→中性樹膠封片。

1.4 數據分析 試驗所得數據用x±s 表示， 使用SPSS18.0 統計軟件進行數據比較；肝臟、腎臟組織石蠟切片，采用顯微成像分析系統（CCD）進行拍照分析。

2 結果與分析

2.1 不同劑量環磷酰胺對黃兔體重、 行為的影響試驗給藥前和給藥結束后第2 d 分別對動物稱重，對照組注射前后黃兔體重（增加）差異極顯著（P<0.01）。 給藥組隨著環磷酰胺注射劑量升高，體重下降越趨明顯， 環磷酰胺濃度為20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg 時， 注射前后黃兔體重無明顯差異 （P>0.05）；環磷酰胺濃度為80 mg/kg 時，注射前后黃兔體重（減輕）有顯著差異（P<0.05）；環磷酰胺濃度為100 mg/kg 時，注射前后黃兔體重（減輕）差異極顯著（P<0.01），見表 1。

表1 不同劑量環磷酰胺對黃兔體重的影響

2.2 不同劑量環磷酰胺對福建黃兔肝臟組織結構的影響 福建黃兔肝臟組織H.E 染色觀察結果：與對照組（見圖1A）相比，劑量組Ⅰ（環磷酰胺注射濃度為20 mg/kg）的肝臟組織結構沒有變化，其中肝索結構輪廓清晰，肝血竇形態正常，肝細胞分布、著色均勻，門管區結構顯示正常（見圖1B）。劑量組Ⅱ（環磷酰胺注射濃度為40 mg/kg） 可見局部肝細胞出現輕度水腫和變性， 但未見有壞死和明顯的炎癥反應現象（見圖1C）。劑量組Ⅲ（環磷酰胺注射濃度為60 mg/kg）的肝細胞索結構稍紊亂，局部肝細胞水腫變性，散在小片狀肝細胞嗜酸性變，細胞核固縮或溶解（見圖1D）。 劑量組Ⅳ（環磷酰胺注射濃度為80 mg/kg）的肝細胞索排列紊亂，大量肝細胞呈現水腫和空泡化病灶，產生小片狀變性壞死，肝血竇出現擴張淤血，多見枯否細胞的現象（見圖1E）。劑量組Ⅴ（環磷酰胺注射濃度為100 mg/kg）有大量肝細胞呈嗜酸性病變，出現大面積凝固性壞死（見圖1F）。

圖1 不同劑量環磷酰胺對福建黃兔肝臟組織結構的影響

2.3 不同劑量環磷酰胺對福建黃兔腎臟組織結構的影響 與對照組（見圖2A）相比，劑量Ⅰ組的腎臟組織沒有明顯變化， 腎小球和腎小管上皮細胞也沒有發現明顯變化（見圖2B）。劑量組Ⅱ出現腎小管上皮輕度變性， 腎間質也呈現輕度水腫現象 （見圖2C）。 劑量組Ⅲ腎小管上皮發生變性，腎間質出現明顯水腫，有大量滲出液淤積，炎癥細胞發生浸潤現象（見圖2D）。 劑量組Ⅳ大量腎小管上皮變性，管壁明顯變薄，管腔變大，腎間質呈現嚴重水腫、出血病癥，腎小囊間隙明顯變小（見圖2E）。劑量組Ⅴ出現大量腎小管上皮細胞壞死、脫落現象，腎小管壁變薄，管腔擴張，間質表現水腫、滲出，大量腎小球缺血、萎縮（見圖 2F）。

圖2 不同劑量環磷酰胺對福建黃兔腎臟組織結構的影響

3 討 論

不同品種品系的試驗動物， 應用環磷酰胺制備免疫抑制動物模型， 其給藥途徑和給藥劑量有所不同，對動物造成的損傷也存在差異。環磷酰胺在生物體內的代謝過程中， 在肝臟經肝細胞色素P450 酶系水解的主要物質有磷酰胺氮芥和丙烯醛[5-7]。 磷酰胺氮芥具有抗腫瘤作用， 而丙烯醛對機體的毒副作用較大，抑制機體骨髓生成以及造成生殖系統、肝臟和腎臟等器官、組織損傷[8]。 環磷酰胺對肝臟的損傷主要是可引起肝細胞壞死，肝小葉中心出現充血，并伴隨氨基轉移酶升高[9]。 付晶等[10]發現，環磷酰胺可導致雛雞肝臟組織細胞內線粒體明顯受損， 并發生細胞凋亡現象。 王怡菲等[11]報道環磷酰胺制備免疫抑制動物模型時，不僅對肝臟產生損傷，腎臟病變主要表現為不同程度的纖維增生和出血現象， 細胞空泡化和核固縮等。

外觀體征行為觀察發現， 環磷酰胺高劑量組（80 mg/kg、100 mg/kg）給藥后期，動物精神萎靡、呆滯，食欲下降，體重明顯下降，出現明顯的肝腎受損癥狀， 如血尿； 環磷酰胺中劑量組 （40 mg/kg、60 mg/kg） 給藥后期， 動物有出現食欲輕微下降現象，個別動物有血尿現象，表明肝腎受損；環磷酰胺低劑量組（20 mg/kg）及對照組動物精神狀況、食欲未出現明顯的反應。由此可見，不同劑量環磷酰胺對福建黃兔體重、行為等有顯著的影響。

本試驗結果表明， 不同劑量環磷酰胺可造成福建黃兔肝腎組織不同程度的損傷。 隨著環磷酰胺注射劑量的不同，病變程度不同，即肝臟、腎臟組織的病變程度與環磷酰胺的注射劑量成正相關。 低劑量（20 mg/kg）環磷酰胺對福建黃兔肝腎組織形態無明顯影響，高劑量（80 mg/kg 及以上）環磷酰胺可誘導福建黃兔肝細胞變性，嚴重壞死，同時可導致腎小管上皮變性，腎間質水腫、滲出，腎小管上皮壞死脫落，腎小球呈現缺血、萎縮等癥狀；二者病變均隨劑量增加而加重。

該研究結果可為用環磷酰胺制備福建黃兔動物免疫抑制模型提供參考依據。