免疫新城疫活疫苗對大腸桿菌感染雞群血清生化指標變化的影響

蔡 羲 林 琳 黃梅清 陳秀琴 鄭 敏 江 斌＊

(1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013)

禽大腸桿菌病（Avian colibacilloisis）是指由部分或全部致病性大腸桿菌（E.coli）引起禽局部或全身性感染的疾病。致病性大腸桿菌可引起不同品種、不同日齡雞發病， 同時又容易與其它病原發生共感染，造成家禽大量死亡或生產力下降，導致嚴重的經濟損失。 隨著集約化、規?；B禽業的發展，大腸桿菌病已成為嚴重威脅養雞業的傳染病之一， 病理剖檢變化主要表現為心包炎、肝周炎、氣囊炎。目前，防治該病主要依靠抗生素治療， 但是由于抗生素的不正確使用，導致細菌產生耐藥性，另外抗生素藥物殘留會造成更為嚴重的食品安全問題，威脅人類健康。疫苗接種有一定的效果， 但由于大腸桿菌抗原結構復雜，血清型眾多，免疫不同血清型疫苗不能產生交叉保護，給該病的防控帶來了較大的困難。筆者通過多年臨床實踐，對于“頑固性”大腸桿菌病，應用新城疫疫苗緊急免疫，能取得較好的防控效果，具體原因尚不清楚。通過對試驗雞人工感染大腸桿菌，雞群發病后免疫新城疫疫苗，再檢測血清某些生化指標，以期揭示患雞免疫新城疫疫苗控制雞大腸桿菌病的原理。

1 材料與方法

1.1 大腸桿菌菌株來源 福建省農業科學院畜禽疾病診療中心分離鑒定的FQ11 株。

1.2 試驗儀器與試劑 全自動生化儀 （TBA40，日本東芝），722E 型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司），普通臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-16G），塑料試管，微量加樣器。 新城疫Lasota 弱毒活疫苗（Ⅳ系），青島易邦生物制品廠生產，批號：20190911；總超氧化物歧酶（T-SOD）試劑盒、溶菌酶試劑盒，購自南京建成生物工程公司。S-S 瓊脂培養基、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂，購自青島海博生物技術有限公司；TP、Alb 測定試劑和校準品均購自德賽診斷系統（上海）有限公司；質控品購自羅氏公司。

1.3 試驗動物 選取由河北峪口禽業有限公司提供的同一批次30 日齡健康海蘭褐蛋雞50 羽， 根據本場免疫程序進行免疫，7、21 日齡進行雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯四價活疫苗免疫， 隨機分為空白組10 羽，對照組20 羽，試驗組20 羽，正常飼喂，不添加任何藥物。

1.4 攻毒試驗 參照周秀紅等[1]的方法進行攻毒試驗，以平板計數法測定細菌含量，將最終細菌濃度調至1×108CFU/mL。 試驗組和對照組胸肌注射攻毒FQ11 大腸桿菌混懸液0.2 mL/羽， 空白組胸肌注射生理鹽水0.2 mL/羽。 各組雞分別隔離飼養，連續觀察3 周，每天詳細記錄雞群發病、死亡情況，并對病死雞進行剖檢，從中分離病原并進行鑒定，以驗證死雞確系攻毒所致。

待部分雞出現臨床癥狀時， 每羽試驗組雞免疫新城疫Lasota 弱毒活疫苗（Ⅳ系）4 羽份。 分別于免疫后第 5 d、 第 10 d、 第 17 d 隨機采集各組血樣8 份，每份 5 mL，分離血清。

1.5 血清溶菌酶含量測定 用比濁法測定血清溶菌酶活性。操作方法及步驟嚴格按照試劑盒說明書，利用分光光度計分別測定空白對照、 標準管和樣品測定管的透光度，每個樣本均重復測定3 次。然后計算血清溶菌酶含量。 Lysin=SC×n×（UT-OT）/（STOT），式中 Lysin 表示血清溶菌酶含量（U/mL）；SC 表示標準管濃度；n 表示稀釋倍數；OT 表示空白對照管透光度；ST 表示標準管透光度；UT 表示樣品測定管透光度。

1.6 血清總蛋白、白蛋白測定 用全自動生化儀檢測樣品?？偟鞍子秒p縮脲法測定，白蛋白用溴甲酚綠法測定，操作方法及步驟嚴格按照試劑盒說明書。

1.7 血清超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，操作方法及步驟嚴格按照試劑盒說明書。 顯色后利用分光光度計測定OD550nm， 結果以亞硝酸鹽單位（U/mL）表示。

1.8 數據統計分析 利用單因素方差分析 （oneway ANOVA，LSD） 進行顯著性檢驗，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。 數據用平均值±標準差（SD）表示。

2 結果與分析

2.1 臨床表現和剖檢病變 雞群接種后第3 d，對照組和試驗組部分雞食欲降低，翅下垂，羽毛蓬亂，反應遲鈍，行動緩慢，消瘦喜睡，排黃綠色稀糞。部檢對照組、試驗組患雞各1 羽，病變表現為心包炎、肝周炎、氣囊炎。以患雞心血、氣囊及肝滲出液接種SS 瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂，37 ℃溫箱培養24 h 后，均有典型的大腸桿菌菌落生長。 空白對照組雞的內臟一切正常。 第4 d，試驗組雞滴鼻免疫新城疫 Lasota 弱毒活疫苗 （Ⅳ系）4 羽份， 免疫后第5 d、第 10 d、第 17 d 抽血化驗。 試驗結束時，試驗組雞死亡4 羽（主要發生在免疫后7 d 內），對照組雞死亡10 羽（發生在整個試驗期）。空白組雞精神狀態正常，未見發病、死亡情況。

2.2 血清中溶菌酶含量檢測結果 由表1 可以看出，血清溶菌酶的含量隨著日齡的增長有所提升。緊急免疫后，試驗組溶菌酶含量高于對照組，免疫后第5 d，兩者差異不顯著（P＞0.05）；免疫后第 10 d，兩者差異顯著（P<0.05）。免疫后第17 d，兩組差異不顯著（P＞0.05），說明緊急免疫新城疫活疫苗后，顯著提高了機體非特異性的免疫應答能力。

表1 免疫后血清中溶菌酶含量的變化

2.3 血清總蛋白、 白蛋白的變化 由表2 可以看出，人工感染5 d，對照組和試驗組雞血清總蛋白、白蛋白含量均低于空白組，差異顯著（P<0.05），試驗組血清總蛋白、 白蛋白含量高于對照組， 免疫后第5 d、第 17 d，兩者差異不顯著（P＞0.05）；免疫后第10 d，試驗組與對照組的指標差異顯著（P<0.05）。 說明緊急免疫， 一定程度刺激機體非特異性的免疫應答能力。血清溶菌酶的含量有所提升， 人工感染后血清溶菌酶含量顯著高于空白組；緊急免疫后第10 d，試驗組溶菌酶含量顯著高于對照組。 說明新城疫活疫苗顯著提高機體非特異性的免疫應答能力。

表2 免疫后血清總蛋白、白蛋白的變化

血清總蛋白是各種蛋白的混合物， 主要隨著白蛋白和球蛋白濃度的變化而變化，本研究發現，人工感染大腸桿菌后，對照組和試驗組血清總蛋白、白蛋白含量均極顯著低于空白組。 這可能是由于臨床癥狀常表現為“肝周炎”，肝細胞受到一定程度的損傷，造成血清總蛋白、白蛋白嚴重低于正常水平。這一結

2.4 血清中SOD 活性的變化 由表3 可以看出，人工感染5 d， 對照組和試驗組血清SOD 含量均高于空白組，差異極顯著（P<0.01），試驗組與對照組間差異不顯著（P＞0.05），免疫后第 5 d，血清 SOD 含量最高，免疫后第10 d、第17 d 三組指標比較接近，說明感染大腸桿菌后， 血清中SOD 含量快速提升，免疫新城疫活疫苗， 對血清SOD 值沒有產生很大影響。

表3 免疫后血清中SOD 活性的變化

3 討 論

溶菌酶是正常機體非特異性免疫防御機制的組成部分之一， 血清中溶菌酶主要由單核-巨噬細胞分泌釋放的一種非特異性免疫物質， 主要通過破壞細菌細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4 糖苷鍵進行殺菌。 通過測定其在血清中的含量及其變動情況， 可作為了解機體免疫功能的一個重要指標[2-4]。 本研究發現，隨著雞日齡增長，果與張軍等[5]報道的結果一致。 免疫后第10 d，試驗組血清總蛋白、白蛋白含量顯著高于對照組，說明新城疫活疫苗一定程度刺激機體非特異性的免疫應答能力。

在本研究中，對照組和試驗組血清SOD 含量均極顯著高于空白組，試驗組與對照組間無明顯差異；免疫后第5 d，血清SOD 含量最高，隨后逐漸下降，接近正常水平， 可能由于大腸桿菌感染引發了機體的代償應激，導致SOD 的表達升高以應對大腸桿菌對機體的侵襲。 組內不同時間點SOD 活性的波動性， 可能是機體抗氧化機制受大腸桿菌感染的實時調控所致。 人工感染后SOD 活性增強，提高了機體抗氧化能力和清除過氧化物的能力， 保護了細胞免受損傷，這種抗氧化調控具有協同性和時效性。這與GILL S S 等[6]報道的SOD 活性在多種脅迫條件下發生上調，過表達SOD 可以消除氧化脅迫的消極影響的結論基本一致。

本研究首次揭示了人工感染大腸桿菌后， 使用新城疫活疫苗緊急免疫后雞血清溶菌酶、 血清總蛋白、血清白蛋白和血清SOD 的變化，這些參數是機體非特異性免疫情況的重要指標， 對無抗預防和治療大腸桿菌病具有一定指導意義。