一株較強致病性雞大腸桿菌的分離與防控

喬欣君 廈門惠盈動物科技有限公司 福建廈門 361023

家禽養殖過程中，細菌性疾病尤為常見，且傳染快、發病率與病死率較高[1]。 某養雞場雞群突發疾病，其癥狀為體溫升高，精神不振，食欲降低或停食，排灰白色稀便，且傳染快、發病急、病死率高。通過解剖分別從肺、肝、脾臟3 種器官分離純化得到活菌數較高的一株病原菌， 最終確定為大腸桿菌（Escherichia coli）。

國內外關于雞大腸桿菌病防治的報道較多[2-5]，其中多數以抗生素類藥物作為治療首選方案， 而抗生素的大量使用會引起多種負面影響， 例如提高細菌的耐藥性、動物機體免疫下降、藥物殘留及其生態環境破壞等[6]。 當有藥物殘留的畜禽肉類產品進入人體并在人體富集，則會對人體健康產生危害[7-8]。農業農村部第194 號公告要求2020 年7 月起飼料端禁抗、養殖端限抗減抗，而益生菌作為有活性的微生物，具有抗菌活性卻無抗生素所帶來的種種弊端，它不僅能改善動物腸道健康， 還能促進食物在動物消化道內消化，提高飼料利用率，是抗生素的替代品之一[9]。

本研究從病死雞的肺、肝、脾臟3 種器官分離出大腸桿菌，通過鏈霉素、新霉素、慶大霉素等9 種抗生素進行藥敏試驗，并利用枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、 植物乳桿菌等9 株益生菌進行大腸桿菌抑制試驗。通過藥敏試驗及益生菌抑菌試驗，從而確定最佳的治療方案， 為雞細菌性疾病的防治提供一條綠色環保的道路， 也為益生菌產品的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣 由某雞養殖場提供病死雞若干羽，且死亡不超過12 h。

1.1.2 供試藥物 鏈霉素、新霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環素、阿莫西林、氧氟沙星、利福平、氨芐西林9 種抗生素藥敏紙片， 購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 供試益生菌 枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、釀酒酵母、產朊假絲酵母，均為本單位實驗室分離保存。

1.2 病原菌分離與鑒定 隨機選取3 羽病死雞，解剖后取出肺、肝、脾臟，用灼熱的刀片燙死表面雜菌，再通過無菌操作分別將組織剪碎， 采用無菌生理鹽水稀釋100 倍混勻后，吸取0.1 mL 涂布營養瓊脂培養基平板，肺、肝、脾臟各1 個平板，總共9 個平板，倒置于37 ℃培養箱培養24 h，長出單菌落后再劃線純化培養。

純化后的菌株采用16S rRNA 細菌通用引物[10]進行擴增， 正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 反向引物為 1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'， 由北京睿博興科生物技術有限公司完成。 所得序列經過NCBI（美國生物技術信息中心） 數據庫的BLAST 進行在線同源性比對，再參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[11]與《常見細菌系統鑒定手冊》[12]方法進行菌株生理生化試驗及鑒定，試驗項目包括：革蘭氏染色特性、芽孢有無、糖發酵試驗、V-P 試驗、吲哚反應、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠液化等。

1.3 藥物敏感性試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法[13]。吸取 1 mL 活菌數約為 108CFU/mL 的菌液，加入15 mL 營養瓊脂培養基中（50 ℃），混合均勻后傾注倒入滅菌培養皿中，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置20 min 后， 將平皿置于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養24 h，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4 益生菌抑菌試驗 采用管碟法[14-15]。取1 mL 菌懸液加入50 ℃ 100 mL 營養瓊脂培養基中， 搖勻（含菌終濃度為105CFU/mL），倒入培養皿中（厚度約為3 mm），待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入 0.25 mL 益生菌培養液 （濃度為108CFU/mL），置于37 ℃下培養24 h。觀察有無抑菌圈產生，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.5 動物模擬試驗 隨機選取60 只健康小鼠，分成3 組、每組20 只，分別為對照組、大腸桿菌感染組、益生菌保護組。 3 組小鼠同等條件飼養3 d 后，感染組皮下注射分離菌1 mL（濃度為106CFU/mL）；益生菌保護組皮下注射分離菌1 mL （濃度為106CFU/mL），同時飲水中加入復合乳酸菌發酵培養物； 對照組注射1 mL 滅菌生理鹽水。 各組隔離飼養，自由飲水，連續觀察7 d。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離與鑒定 病死雞肺、肝、脾臟經剪碎、稀釋100 倍后涂布培養，分離得到圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起的菌落，且該菌株在3 個器官中均有分布，活菌數較高。 純化后的菌株采用 16S rRNA 擴增測序， 獲得的片段長度為1 417 bp，擴增測序結果見圖1。 該菌株基因序列通過BLAST 軟件進行同源性比對，結果與Escherichia coli SCU-308 的同源性為99.93%。

圖1 菌株基因擴增測序結果

該菌株的生理生化試驗結果為： 革蘭氏染色陰性、無芽孢，MR 試驗、吲哚反應、糖發酵試驗等為陽性，V-P 試驗、淀粉水解試驗為陰性，結果見表1。 結合16S rRNA 擴增測序結果，通過查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》與《常見細菌系統鑒定手冊》，可以確定該菌株為大腸桿菌。

表1 菌株生理生化特性

2.2 藥物敏感性試驗 從病死雞中篩選獲得的大腸桿菌，用鏈霉素、新霉素、慶大霉素等9 種抗生素進行藥敏試驗，以確定該菌株的耐藥性。該大腸桿菌分離株對鏈霉素表現敏感， 對卡那霉素表現中度敏感，對新霉素、慶大霉素、四環素等其它7 種常見抗生素表現不敏感（見表2）。 該結果與于鵬杰[16]、程漢等[17]及郭延敏[18]的研究結果存在差異，說明不同來源分離的大腸桿菌，其耐藥性差異較大，且表明抗生素的長期使用提高了大腸桿菌的耐藥性[19-21]。

表2 大腸桿菌對9 種藥敏紙片的敏感性

2.3 益生菌抑菌試驗 用本單位實驗室的9 株益生菌對大腸桿菌進行抑制試驗。由表3 結果可知，大腸桿菌對植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌表現極敏感，對凝結芽孢桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌表現高敏感， 對枯草芽孢桿菌表現低敏感，對酵母菌不敏感。 有研究表明[22-24]乳酸菌通過產生抗菌物質，從而達到抑制有害細菌的生長，其中植物乳桿菌、 干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌是產生抗菌肽來達到抑制病原菌的作用[25-28]。

表3 9 種益生菌對大腸桿菌的抑制效果

2.4 動物模擬試驗 將分離得到的大腸桿菌及植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等乳酸菌復合發酵培養的發酵液進行動物（小鼠）試驗。試驗表明，未作任何處理的對照組7 d 內無小鼠死亡； 大腸桿菌感染組小鼠在3 d 內死亡率達90%； 益生菌保護組小鼠在注射分離菌后第1 d 死亡2 只， 死亡率為10%，與大腸桿菌組差異顯著（P＜0.05），見表 4。剖檢死亡小鼠， 可見肝臟水腫、 脾臟及肺點狀出血等癥狀，取小鼠的肺、肝、脾臟劃線接種營養瓊脂平板，長出菌落；劃線純化，經過16S rRNA 擴增測序，表明該菌與試驗注射的大腸桿菌為同種細菌， 說明該大腸桿菌對小鼠有較強的致病能力。 而解剖存活的益生菌保護組小鼠，未見剖檢病變，說明復合乳酸菌發酵液能有效抑制大腸桿菌。

表4 動物模擬試驗結果

3 結 論

從病死雞的肺、肝、脾臟中分離出一株具有較強致病性的大腸桿菌，該菌對新霉素、慶大霉素、四環素等7 種常見抗生素具有耐受性，而對植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等乳酸菌敏感。通過動物試驗表明， 本次試驗所用的復合乳酸菌發酵液能有效抑制大腸桿菌， 從而降低或預防由大腸桿菌引起的細菌性疾病的發生。 建議在實際養殖過程中，若發生細菌性疾病，應先做藥敏試驗，對癥用藥，避免抗生素的濫用。 或在日常養殖過程中使用益生菌產品，以減少或預防細菌性疾病的發生，從而減少或替代抗生素的使用。 根據本次試驗所用復合乳酸菌抑制大腸桿菌的研究結果， 后續將進一步檢測乳酸菌對其它種類致病菌的抑制效果，同時優化菌株復配、發酵培養基及發酵培養條件等相關技術問題， 為益生菌產品開發奠定良好的基礎。