非洲豬瘟研究新進展

劉金林 李兆龍 羅錦義

（1.龍巖市農業學校 福建龍巖 36400；2. 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福建福州 350013）

由非洲豬瘟病毒引發的非洲豬瘟是豬的一種急性傳染病，它的發病特點是病程短、病死率高。 我國將其列為一類動物疫病， 世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病。

該病最早可以追溯到1900 年的英屬東非農場，隨后擴散至歐洲， 后來又進入南美洲和加勒比。2007 年，該疫病擴散到高加索地區，隨后在全球多個國家發生、擴散、流行。 2018 年8 月傳入我國，并迅速在全國擴散。因為沒有有效的疫苗，目前非洲豬瘟的防控主要通過撲殺控制傳染源， 清洗消毒切斷傳播途徑。但對于易感的動物（豬），并沒有其它有效的防護措施，這給防控帶來巨大的困難和挑戰。為了防止疫情的進一步惡化，也為了切實做好疫情防控，本文從非洲豬瘟的病原學、 臨床癥狀等方面進行綜合闡述。

1 病原學

1.1 病毒的分類及形態結構 ASFV 屬于非洲豬瘟病毒科、 非洲豬瘟病毒屬的唯一成員。 它是雙鏈DNA 病毒， 有囊膜和衣殼， 病毒顆粒呈20 面體結構[1-2]。 衣殼由 1892~2172 個殼粒構成，中心有孔，呈六棱鏡狀，殼粒間間距為7.4~8.1 nm。 直徑達175~215 nm，基因組全長 170~193 kb，編碼 150~167 個蛋白[3]。 根據病毒p72 基因的末端序列，可分為23 個基因型，其中基因I 型最早發現在東非、西非、中非和歐洲，基因II 型則是近年來格魯吉亞、俄羅斯周邊、歐洲以及當前我國主要流行株，而基因XXIII 型發生東非埃塞爾比亞[4]。

1.2 病毒編碼蛋白 根據非洲豬瘟編碼蛋白的功能（見圖 1）可將其分為以下 7 類。 （1）病毒結構和 形 態 的 組 成 蛋 白 ：p72、P150、p37、p34、p14、p5、p35、p15、p8、ps273r、p17、pe183l、p49、pe120r、p10 和pa104r[5-6]；（2）病毒轉錄和 RNA 修飾蛋白：pb962l、pd1133l、pnp1450l、Pep1242l、pg1340l、pq706l、pnp86 8r、pc475l、ph359l、pd205r、pd339l、Pep424r 和 pc147l；（3）維護基因組完整性蛋白：po174l、pnp419l、pe296r和 pe165r； （4） 主 導 病 毒 入 侵 蛋 白 ：p12、pe248r和 pe199l[7-8]；（5）逃避宿主防御的蛋白：Pep402r 和pa224r；（6） 其它已知蛋白質：pr298l、pb119l、p22、p32、p11.5、Pep152r 和 ph339r； （7） 未 知 的 蛋 白 ：pM1249L、pCP123L、pC129R、pC717R、pI177L、pK14 5R、pK421R、pE146L、pF317L、pH240R、pCP312R、p E423R、pE184L、pC257L、pH171R、pB117L、pB169L、pEP84R、pI73R、pC122R、pQP383R、pM448R 和 pH 124R[9]。

圖1 病毒蛋白功能分類

1.3 非洲豬瘟病毒結構的蛋白分布 根據病毒圖譜的數據，圖2 展示了40 種病毒蛋白在5 個病毒結構域的分布位置。 （1） 包外囊膜， 包括 p12、p24 和CD2v[10]；（2）病毒衣殼，由 p14、p49 和 p72 構成[11]；（3） 內囊膜由已知 7 個膜蛋白組成，p12[pO61R]、p17[pD117L]、p22、p54[pE183L]、pE248R、pH108R 和pE199L[12]；（4）核殼，主要由蛋白質降解產物 pp220(ORF CP2475L)和 pp62(CP530R)組成，分別占病毒質量和病毒蛋白酶的三分之一[13]。（5）蛋白二十面體衣殼，由主要的衣殼成分P72 和副衣殼蛋白P49 組成，它們都參與了該結構域的組裝，以及介導細胞內病毒運輸的蛋白 pE120R[14]。 （6）類核，包括 RNA 聚合酶亞基 （RP1、RP2、RP3、RP4、RP5、RP6 和 RP7)，轉錄因子（pD1133L、pQ706L、pG1340L 和 pB962L），RNA 修飾酶（PolyA Capping 酶、甲基轉移酶），結合DNA 的主要結構蛋白（p10、pA104R），堿基切除修復蛋白（DNA pol X、DNA 連接酶、AP 內切酶）等[15]。

圖2 非洲豬瘟病毒結構的蛋白分布

1.4 病毒的理化特性 非洲豬瘟病毒屬于熱敏性病毒，56 ℃持續 30 min 就可滅活， 但在 5 ℃以下的低溫環境則可存活數年，甚至更長時間。 此外，病毒對堿性不敏感，在pH 4~10 溶液中可穩定存活較長時間[16]。 此外，病毒的顆粒較大，梯度密度在1.19~1.24 g/cm3[17]。

1.5 病毒的體外培養特性 非洲豬瘟病毒體外培養的細胞主要為原代單核-巨噬細胞， 接種48 h 后出現明顯的圓縮腫脹、脫落和溶解等細胞病變；它也可在脾臟、淋巴結、肺、腎臟的網狀細胞上增殖。部分報道該病毒可以在雞胚卵黃囊和骨髓細胞中增殖。少數的適應毒株可在豬腎細胞系（PK）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、倉鼠腎細胞（BHK-21）以及豬睪丸細胞（ST）等增殖并引起細胞病變[18]。

1.6 非洲豬瘟病毒的適應力 非洲豬瘟病毒在體內外環境中穩定存在，病毒在污染的環境、糞便、肉制食品、冰凍肉、半熟肉、泔水、腌制火腿以及未經燒煮或高溫煙熏的火腿和香腸都能存活[19]，具體存活時間見表1。

2 非洲豬瘟的臨床特征及病理變化

2.1 非洲豬瘟的臨床特征 根據非洲豬瘟的臨床病程特性，可將非洲豬瘟分為超急性、急性、亞急性或隱性感染。其中超急性型多發生在非洲地區，臨床表現為突發性死亡，死亡率高；急性型表現為持續高燒，昏睡、厭食、皮膚出血以及循環系統、呼吸系統、消化系統出現問題并伴有神經失調， 該癥狀多見于我國， 這些急性-亞急性的ASF 臨床癥狀與古典豬瘟（CSF）、豬丹毒、沙門氏菌病、放線桿菌病、其它敗血癥、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）等的臨床癥狀非常類似，有時候容易混淆，應注意鑒別（見表2）[20]。

表2 急性非洲豬瘟臨床癥狀及鑒別診斷

2.2 病理變化 感染不同毒性的非洲豬瘟病毒后，產生病變是不同。 急性和亞急性非洲豬瘟病毒感染后常表現出特征性的廣泛出血和淋巴組織壞死。 急性非洲豬瘟鑒別診斷通常以脾臟腫大的癥狀為主，其次為淋巴系統病變。之前病理檢測研究報道，感染非洲豬瘟的野豬， 出現脾臟腫大的病例占比達到100%，同時還出現淋巴結腫大（94.12%）、出血性淋巴腺炎（88.23%）、胸膜積水（88.23%）、扁桃體出血（88.23%）、扁桃體化膿（52.94%）、肝腫大（88.23%）、休克肺（70.95%）、細支氣管間質性肺炎(64.7%)、心包積水 （70.59%）、 心臟出血 （47%）、 腸道出血（76.47%）、派爾集合淋巴結壞死（35.29%）、腎臟出血（41.17%）等癥狀（見圖 3）[21]。 而慢性和亞急性非洲豬瘟病毒感染， 病變則很輕微或肉眼幾乎看不見病變。

圖3 非洲豬瘟的病理變化

3 病毒的入侵機制

非洲豬瘟病毒顆粒較大，直徑約200 nm，主要感染豬的巨噬細胞。因此，多數研究認為病毒利用受體介導的內吞作用進入宿主細胞。 內吞途徑包括巨胞飲、網格蛋白依賴型內吞、小窩蛋白依賴型內吞、小窩蛋白非依賴型內吞和其它途徑（見圖4）。 其中網格蛋白依賴的內吞 （Clathrin dependent endocytosis）和巨胞飲（Macropinocytosis）是病毒入侵的主要方式[22]。

圖4 非洲豬瘟入侵模式

非洲豬瘟病毒巨胞飲入侵是一種非特異的內吞形式，被認為是病毒入侵的主要方式之一。 它是不依賴于配體，病毒首先結合于細胞膜上，然后在肌動蛋白驅使形成大且不規則的原始內吞小泡 （巨胞飲體），然后巨胞飲體向細胞中心移動，由脫水而變小、酸化[23]。

網格蛋白在非洲豬瘟病毒的入侵中起著關鍵的作用。 研究認為， 大部分病毒通過pE248R 蛋白和p12 蛋白共同作用結合在細胞表面的受體， 形成配體-受體復合物激活一些蛋白激酶， 磷酸化膜受體分子上特定入胞基序（Motif）。 磷酸化后入胞基序，改變膜受體分子構象， 顯露出受體與適配子蛋白結合的信號序列，使環狀結構收縮，實現囊泡與胞膜的脫離[23]。

非洲豬瘟病毒入侵宿主細胞后， 進入胞質，在p37 蛋白作協助下將病毒的核衣殼轉移至宿主細胞核周圍，接著，病毒開始復制相關DNA 聚合酶的轉錄。 病毒早期基因表達轉向晚期基因表達， 病毒DNA 進入并聚集于細胞核，進行DNA 復制，復制后的病毒DNA 與蛋白p37 一起轉運到細胞質，聚集于細胞質進行病毒的包裝。多聚蛋白pp220 和pp62 的蛋白酶解加工促進了病毒的裝配成熟。 經過裝配以后，成熟的ASFV 顆粒離開病毒工廠，依賴于微管和驅動蛋白，在宿主的細胞質中進行病毒裝配，然后裝配好的病毒粒子轉移到細胞膜， 經細胞膜釋放到胞外，進行下一輪的感染。然后經血液或淋巴轉移至病毒二次復制的場所---淋巴結、骨髓、脾、肺、肝和腎。病毒血癥通常在感染后4~8 d 出現，由于缺乏中和抗體，將持續數周或數月。 ASFV 易與血液紅細胞膜和血小板相互作用， 能夠引起感染豬的血細胞吸附現象。 急性病例中的出血機理是由于在疾病后期內皮細胞中復制的病毒使內皮細胞的吞噬活性增強引起的。 亞急性病例中的出血機理主要是因為血管壁的通透性升高而引起[23]。

4 非洲豬瘟的實驗室診斷方法

非洲豬瘟的實驗室診斷方法較多， 目前應用較多的是 ELISA、PCR 以及熒光定量 PCR 等常用方法。

4.1 病毒分離、動物接種及紅細胞吸附 病毒分離及動物接種是疫病診斷的關鍵技術， 通常將疑似非洲豬瘟的樣品接種易感細胞或動物而進行的檢測。然后通過是否產生細胞病變（CPE）來判斷。 紅細胞吸附檢測法，是因為非洲豬瘟病毒感染白細胞，周圍會吸附豬紅細胞形成“玫瑰花環”，該現象稱為紅細胞吸附反應（HAD），因此，紅細胞吸附試驗是檢測該病毒的特有技術[24]。

4.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 使用ELISA 檢測病毒抗原，短時間內可對樣品進行大規模篩查，而且其成本比 PCR 更為低廉， 因此，OIE 將 ELISA 作為診斷非洲豬瘟的首選血清學方法。 目前國內外常以VP73、VP72、P54、P32、P30 作為抗原檢測的蛋白[25]。

4.3 膠體金免疫層析（GICA）試紙條 使用膠體金免疫層析試紙條，方便快速，成本低，不需要特殊的儀器設備，便于基層和現場使用。 因此，它的應用范圍廣，可適應多種檢測條件，可進行多項檢測，可以節省樣品，降低成本；此外，膠體金標記物穩定，標記樣品在4 ℃貯存兩年以上，無信號衰減現象等優勢。當前， 主要有針對P54 蛋白制備用于檢測ASFV 的膠體金免疫層析試紙條[26]。

4.4 PCR 檢測方法 目前，PCR 是最常用的ASFV實驗室檢測方法，因為該方法簡單快速、靈敏度高和特異性強。 但是PCR 的缺點是容易發生交叉污染，應該采取適當的預防措施來減少和控制污染風險的發生。目前主要根據 ASFV 的 VP72、VP73 和 P54 基因建立了能夠診斷ASFV 的特異性PCR 方法，有單重和多重PCR 檢測方法已成功應用于豬樣品 (血液、器官等)和蜱中ASFV 基因組的檢測[27]。

4.5 熒光定量PCR 方法 實時熒光定量PCR 有敏感性高和特異性好的優點， 可同時快速進行大批量的樣品檢測。 根據 ASFV 的 VP72、VP73、P54 基因各自設計引物和探針，建立了Taq Man 實時熒光定量PCR 方法。郭少平等[28]、王建華等[29]建立了實時熒光定量PCR 方法檢測ASFV。 于恒智等[30]則建立了一種可同時鑒別檢測5 種病的多重熒光定量RTPCR 方法。

4.6 其它方法 根據ASFV VP72 基因保守序列設計并合成引物， 分別建立了線性指數聚合酶鏈式反應（LATE-PCR）技術、環介導恒溫擴增（LAMP）技術、重組酶聚合酶擴增（RPA）和探針雜交技術[31]。

5 疫苗研究進展

5.1 滅活疫苗 非洲豬瘟發現之后，陸續有研究開展滅活疫苗的研制。 研究表明，ASFV 滅活抗原免疫動物后能夠誘導產生ASF 特異性抗體，但未能提高疫苗的免疫保護效果。此外，研究人員也證實在細胞傳代過程中， 低代次和高代次的ASFV 毒株對中和抗體的敏感性存在差異。 隨后很多的滅活苗被證實作用微弱， 這些研究結果證實由于滅活疫苗自身固有的缺陷， 很難刺激免疫系統誘導產生高效抗體，即使部分能刺激豬產生抗體， 也無法抵御ASFV 的攻擊。

5.2 弱毒苗 部分弱毒疫苗雖然能抵御強毒的攻擊，但1/4 的免疫豬卻出現了ASF 臨床癥狀，并且有部分豬出現死亡現象。 接種經細胞傳代致弱獲得的KK262 免疫小豬，不能抵御野生型K49 株的攻擊[32]。而接種自然傳代缺失了約10 kb 基因序列致弱的OURT88/3 株，可促進I 型干擾素的產生及增強機體的免疫反應[33]。O′Donnell V 等[34]將多基因家族（MGF家族）的多個基因刪除后獲得ASFV-G ΔMGF 株免疫小豬， 結果發現其具有良好抵御強毒株ASFV-G攻擊的能力。其它弱毒株有Benin ΔDP148R、ASFVG-Δ9GL/ΔUK、Ba71 ΔCD2v、Pret4 Δ9GL、OURT88/3 ΔDP2 及 NHV/P68 等[35-36]，它們的保護能力各不相同，除了所缺失基因不同外，還與基因型相關（見表3）。 Borca M V 等[37]通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術構建了 ASFV 弱毒株（ASFV-G/Δ8-DR）。 近期，西班牙科學家針對拉脫維亞2017 年感染ASFV 發病野豬的突變基因而開發的疫苗（Lv17/WB/RIE1）免疫豬后產生較高的抗體水平， 但尚需進一步試驗驗證[38]。 已有報道的非洲豬瘟弱毒疫苗見表3。

表3 已有報道的非洲豬瘟弱毒疫苗

5.3 亞單位疫苗及核酸疫苗 亞單位疫苗主要是通過原核或真核細胞表達具有中和表位的非洲豬瘟病毒保護性抗原， 通過MHI 遞呈給抗原遞呈細胞，以誘導抗非洲豬瘟病毒的中和抗體的產生。 研究發現 p72、CD2V、p12、p30 和 p54 等病毒結構蛋白可誘發機體產生免疫應答[39-45]。 Lacasta A 等[46]構建的核酸疫苗， 結果發現它的保護能力只能達到60%。接著針對 p12、p30、p54、p72、CD2V 單個或多個蛋白的亞單位疫苗研究， 結果發現很難提供較為全面的保護（見表 4）。

表4 非洲豬瘟核酸疫苗及亞單位疫苗

p30、p32、p54 及 p72 等 基 因 也 是 病 毒 載體疫苗研究的對象[47]，其它病毒載體疫苗見表5。而 Lokhandwala S 等[48]和 Loperamadrid J 等[49]構建的載體疫苗，其保護能力還有待驗證。

表5 其它病毒載體疫苗

總之，疫苗的研究雖然取得一些進展，但離實際應用還有一段路要走，還需要各國共同努力。