基于DNA條形碼的向日葵田彎管列當種群遺傳多樣性研究

張毅笑 魏守輝 姜翠蘭 黃兆峰 蘇杰天 孟帥帥 云曉鵬 白全江 吳文龍 黃紅娟

摘要 彎管列當是危害我國向日葵最嚴重的寄生雜草。為了明確我國向日葵田彎管列當種群的遺傳多樣性，本試驗利用rbcL、matK、ITS2條形碼序列對采自我國向日葵主產區的58份彎管列當樣品進行PCR擴增及測序，采用Vector NTI軟件對測序結果進行剪切比對，利用MEGA 6.0軟件計算種內遺傳距離并構建系統發育樹。利用掃描電鏡觀察其種子的顯微形態特征。結果表明，3個DNA 條形碼序列中僅ITS2片段擴增測序結果理想并表現出較好的聚類結果。各樣品ITS2序列剪切比對后長度為453 bp，種內遺傳距離為0.002～0.007，通過比較各樣品ITS2序列的堿基組成和差異位點，能將不同彎管列當種群區分開。ITS2聚類結果表明58份彎管列當樣品聚為3類，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。形態分類結果表明，不同類型彎管列當在植株形態、種子形狀及微觀形態結構等方面存在差別。由于不同彎管列當種群的生境、寄主（向日葵栽培品種）不同，其種群遺傳進化差異顯著。基于ITS2 條形碼和掃描電鏡形態學觀察相結合的方法可用于彎管列當種群遺傳多樣性研究。

關鍵詞 彎管列當; DNA條形碼; ITS2序列; 種子形態; 遺傳多樣性

中圖分類號： S453

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021039

Abstract Orobanche cernua Loefling is the most serious parasitic weed that threats the production of sunflower in China. To clarify the genetic diversity of different O.cernua populations in sunflower fields， barcode fragments of rbcL， matK and ITS2 were used for PCR amplification and sequencing of 58 samples of O.cernua collected from main sunflower-producing areas. The sequencing results were assembled using the Vector NTI software. MEGA 6.0 was used to calculate the intraspecific genetic distance and construct phylogenetic trees. The microscopic morphological characteristics of O.cernua seeds were observed by scanning electron microscope. The results showed that， among the three DNA barcodes， only the results of amplification and sequencing of ITS2 fragments were satisfactory and showed better clustering effect. The length of ITS2 sequences after shear alignment was 453 bp. The intraspecific genetic distance was 0.002-0.007. By comparing the base composition and differential sites of ITS2 sequences of each sample， different O.cernua populations could be distinguished. The clustering results of ITS2 showed that 58 samples of O.cernua were divided into three groups， which could be classified as type Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. The results of morphological classification showed that there were differences in plant morphology， seed shape and micro-morphological structure among different types. There were significant differences in the population genetic evolution among different O.cernua populations originated from different habitats and hosts （sunflower cultivars）. The method based on ITS2 barcoding and morphological observation by scanning electron microscope could be used to study the population genetic diversity of O.cernua.

Key words Orobanche cernua; DNA barcoding; ITS2 sequence; seed morphology; genetic diversity

彎管列當Orobanche cernua Loefling是列當科Orobanchaceae列當屬Orobanche的根部全寄生性雜草，廣泛分布于世界各地。在我國主要分布在吉林、內蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、青海和新疆等地，可寄生在向日葵根上對其產量和品質造成嚴重危害[14]。彎管列當被認為是起源于保加利亞，寄主為菊科Asteraceae蒿屬Artemisia植物或禾谷類植物。20世紀50年代隨著向日葵廣泛種植、引種，其寄主發生適應性改變[5]。1957年彎管列當首次在我國河北省懷來縣向日葵Helianthus annuus L.上被發現和報道[6]。近年來，由于向日葵播種面積不斷擴大，該雜草已擴散至我國向日葵主要產區內蒙古、新疆等地[3]，嚴重阻礙了向日葵生產，被列為國家進境檢疫性雜草[7]。由于彎管列當在中國分布范圍廣，不同地區向日葵種源復雜、生境不同，造成彎管列當遺傳背景復雜且存在不同致病力生理小種的分化[810]，從而導致不同彎管列當種群的形態、遺傳進化程度存在一定差異。在對我國向日葵田彎管列當的危害進行調查時發現，不同彎管列當種群形態上存在明顯差別，主要表現在植株大小、花序形態和花朵數目等方面，但不同種群的致病力、生理小種以及之間的親緣關系仍不清楚。而明確不同形態彎管列當種群遺傳多樣性及親緣關系，對防治彎管列當和向日葵抗性育種具有重要的科學意義。

由于彎管列當在植株大小、花序長度、花萼裂片分裂度及花的顏色和大小等方面有變化，其命名較為混亂。根據《中國植物志》的描述，在《蘇聯植物志》和《內蒙古植物志》中，將彎管列當鑒定為O.cumana。實際上，O.cumana是O.cernua的一個變種，在《中國植物志》和《巴基斯坦植物志》中，已經將O.cumana及O.cernua var. cumana（Wallr.）G. Beck作為O.cernua的異名處理[11]。目前，這兩個名字在文獻中都有記載，因此有關其分類鑒定及遺傳多樣性分析至關重要。國內外已有從形態學、分子生物學、遺傳多樣性方面研究列當屬植物分類鑒定的報道。王定國等[12]和Pujadas-Salvà等[13]采用形態學分類方法，通過植株外部形態特征和種子電鏡掃描顯微形態特征對O.cumana和O.cernua進行分類，結果表明二者親緣關系較近，但在植株大小、花序形狀、花朵數目以及種子顯微形態特征等方面存在明顯的區別。其中，O.cumana植株細高，穗狀花序松散，有20～50朵花，花冠白色或者淡藍色，種子形狀不規則，種臍不明顯，種皮表面有脊狀突起的方形大網紋，網紋里有形狀規則的小網眼;而O.cernua植株比O.cumana植株矮，花序較密集，有50～70朵花，花冠藍色、深紫色或紫色，種子橢圓形，種臍明顯，種皮表面有長方形大網紋，網紋里有形狀不規則的小雕痕。Pineda-Martos等[14]利用共顯性SSR分子標記研究了西班牙向日葵田O.cumana群體的遺傳多樣性，結果表明在同一種群中同時存在兩個基因庫，并且它們之間發生了基因重組。遠緣基因庫之間的基因重組是產生新變異的重要機制，也可能導致該物種進化。Benharrat等[15]利用rbcL（葉綠體1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基編碼基因rubisco large subunit）質體基因進行核苷酸序列分析，并結合形態學特征對采自法國西部的120多份列當屬樣品進行鑒定，提出了將分子鑒定和形態特征分析相結合來確定物種的新方法，并討論了rbcL在分類學中的應用價值。Kirilova等[16]基于核糖體ITS （internal transcribed spacer，核糖體內部轉錄間隔區）序列的種屬區分方法，對從保加利亞不同地區土壤樣品中分離的Phelipanche ramosa L.、P.mutelii、O.cumana種子進行分類鑒定，研究3個物種的種群結構和種內變異，結果表明O.cumana種群目前是穩定的，P.mutelii種群正處于活躍擴張時期，而P.ramosa種群正在收縮。雖然國內外已有列當種群分類鑒定的相關報道[1213]，但形態學上有差異的彎管列當種群分化和進化關系以及種群內的遺傳結構、遺傳多樣性尚不明確。近年來，隨著分子技術的飛速發展，DNA 條形碼技術（DNA barcoding）在生物多樣性評估和物種鑒定中的應用越來越廣泛[1720]。DNA 條形碼（DNA barcode）是利用生物體內一段標準的、高度保守的、易擴增且相對較短的DNA 片段對物種進行快速分類的技術，是對傳統形態學方法的有效補充[21]。利用DNA條形碼技術結合傳統分類學方法，可從形態、分子水平對不同彎管列當種群進行分類鑒定及遺傳多樣性分析。

目前，國內針對彎管列當的研究主要集中在寄生機理、生物學特性、生理小種鑒定、危害和防除等方面，有關彎管列當群體內遺傳多樣性的研究鮮見報道，尚無人采用DNA條形碼技術結合傳統分類學方法對彎管列當種群進行分類鑒定及遺傳多樣性分析。本研究利用rbcL、matK（tRNA成熟酶編碼基因maturase K）、ITS2保守區段的序列特征和變異特點對采自我國向日葵主產區的58份彎管列當樣品進行遺傳進化差異分析，同時結合彎管列當種子掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）形態差異分析結果，探討不同彎管列當種群的遺傳結構和親緣關系，分析我國彎管列當種群的遺傳進化程度，以期為防治彎管列當和向日葵抗性育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料彎管列當于2017年-2019年每年8月、9月從北京、河北、吉林、內蒙古和新疆向日葵田采集，共計58份樣品。其中，北京延慶樣品1份（BJ1）;河北省涿鹿縣、蔚縣樣品3份（HB1，HB2，HB3）;吉林省農安縣、長嶺縣、大安市、通榆縣、洮南區樣品14份（JL1，JL2，JL3，JL4，JL5，JL6，JL7，JL8，JL9，JL10，JL11，JL12，JL13，JL14）;內蒙古開魯縣、武川縣、四子王旗、察哈爾右旗、達茂旗、烏拉特前旗、五原縣、臨河區樣品20份（NM1，NM2，NM3，NM4，NM5，NM6，NM7，NM8，NM9，NM10，NM11，NM12，NM13，NM14，NM15，NM16，NM17，NM18，NM19，NM20）;新疆新源縣、鞏留縣、北屯市、布爾津縣、哈巴河縣、吉木乃縣樣品20份（XJ1，XJ2，XJ3，XJ4，XJ5，XJ6，XJ7，XJ8，XJ9，XJ10，XJ11，XJ12，XJ13，XJ14，XJ15，XJ16，XJ17，XJ18，XJ19，XJ20）。采集的彎管列當植株和種子樣品，帶回實驗室后于-20℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及檢測

稱取彎管列當頂端幼嫩組織或苞片30 mg于2 mL離心管中，同時加入2粒直徑3 mm的無菌鋼珠，裝入適配器后液氮冷凍2 min，使用TissueLyser Ⅱ樣品破碎儀（北京天根生化科技有限公司）30 Hz破碎45 s，將樣品破碎至粉狀，利用新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320-03，天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的完整性，使用NanoDrop One超痕量UV分光光度計（基因有限公司）檢測DNA的濃度和純度，并將DNA稀釋至工作濃度30 ng/μL，置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 PCR擴增及測序

參考國際DNA條形碼通用引物[2224]進行PCR擴增、測序及分析（表1）。PCR反應采用30 μL體系，包括DNA模板1 μL、上、下游引物各1 μL、2×TSINGKE Master Mix 15 μL、ddH2O 12 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，最適退火溫度退火30 s，72℃延伸相應時間，共35個循環;72℃延伸10 min。置于T100TM PCR擴增儀（Bio-Rad公司）完成擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。最后利用Tanon-3500凝膠圖像分析系統（北京原平皓生物技術有限公司）觀察，選取條帶清晰、單一的PCR產物送至北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數據分析

應用Vector NTI軟件對各個樣品測序峰圖進行質量分析，通過逐一檢查、校對堿基去除低質量的序列區并將正反序列拼接。利用MEGA 6.0軟件對拼接后的序列進行多重序列比對，計算樣品間的遺傳距離以獲取DNA條形碼序列變異信息[25]。利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，分析各樣品間的親緣關系，各個分支的bootstrap置信值以1 000次重復來檢驗。

以“ITS2”、“Orobanche”為關鍵詞在NCBI數據庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下載國內外相關序列37條，利用MEGA 6.0軟件將本研究中3種代表型ITS2序列與國內外相關序列進行同源序列比對，構建NJ系統進化樹，分析本研究彎管列當種群與國內外彎管列當的親緣關系。

1.3 種子外觀形態觀察

1.3.1 種子形態測定

利用100目、120目篩選出成熟飽滿的種子，依次用2%次氯酸鈉和75%乙醇超聲清洗2 min后用無菌水沖洗3遍以上至無色，放置2 d脫水干燥。在超景深三維顯微鏡（KEYENCE，日本）下觀察各種群種子形態，每個種群測量30粒種子的長、寬值。利用R語言3.5.2中的兩獨立樣本t測驗來比較不同類型間種子的長度、寬度、大小（長×寬）、形狀（長/寬）的差別。

1.3.2 種子的掃描電鏡觀察

將上述消毒處理后完全干燥的種子作為SEM觀察材料。將待觀察的種子粘在涂有導電碳素標簽的鋁存根上，用雙面膠固定在樣品臺上，涂覆金鈀后在日立SU-8010型掃描電鏡下觀察種子顯微形態特征并拍照。

參考文獻中的專業術語[12， 26]，對不同彎管列當種子進行形態特征描述。

2 結果與分析

2.1 序列特征

將58份彎管列當樣品的rbcL、matK、ITS2片段測序結果進行剪切比對，結果表明不同DNA條形碼片段在序列長度、PCR擴增及測序成功率、核苷酸差異位點數上均有明顯差異（表2）。由于參試樣品的rbcL、matK片段無核苷酸差異，種內遺傳距離均為0，且matK序列片段的PCR擴增成功率太低（17%），因此不適用于后續分析。58份彎管列當的ITS2片段存在3個核苷酸差異位點，種內遺傳距離為0.002～0.007，通過ITS2序列能將不同彎管列當種群區分開，后續將對ITS2片段的差異位點、遺傳多樣性等進行分析。

2.2 基于ITS2序列的遺傳聚類分析

使用Vector NTI和MEGA 6.0軟件分析各樣品的ITS2序列，采用鄰接法構建系統發育樹，結果顯示58份彎管列當樣品聚為3類（圖1）。其中，采自北京（BJ1）、河北（HB1、HB2、HB3）與吉林（JL4、JL6、JL8）的7份樣品親緣關系較近，聚為一類，定為Ⅰ型;采自新疆、內蒙古與吉林的樣品中有50份樣品聚為一類，定為Ⅱ型;采自內蒙古開魯縣的NM1介于兩者之間，定為Ⅲ型。

2.3 基于ITS2序列的差異位點、遺傳距離分析

58份彎管列當樣品的ITS2序列存在3個差異位點，分別是106位C/T、175位C/T、及273位G/T差異。在106位和175位Ⅰ型和Ⅲ型堿基為C，Ⅱ型堿基為T;在273位Ⅰ型堿基為G，Ⅱ型和Ⅲ型堿基為T（圖2）。由于同一類型堿基序列相同，故選用3個類型計算遺傳距離，結果表明Ⅰ型與Ⅱ型親緣關系最遠，遺傳距離為0.006 7，Ⅰ型與Ⅲ型親緣關系最近，遺傳距離為0.002 2，Ⅱ型與Ⅲ型遺傳距離為0.004 4。

2.4 彎管列當系統進化樹分析

將3種類型彎管列當的ITS2序列測序結果與NCBI數據庫中相關序列進行比對，聚類結果表明采集到的58份樣品均為彎管列當。其中，Ⅰ型、Ⅲ型與中國、美國、西班牙、格魯吉亞、澳大利亞報道的O.cernua（NCBI登錄號AY911235.1、EU655624.1、AY960726.1、AY209230.1、AY209231.1、AY209232.1、AY209233.1）親緣關系較近聚為一類;Ⅱ型與以色列、中國報道的O.cernua var. cumana、O.cernua （NCBI登錄號EU655627.1、KC811238.1）親緣關系最近聚為一類（圖3）。

2.5 形態學鑒定結果

田間采樣過程中發現Ⅰ、Ⅱ型植株形態存在顯著差異，其中Ⅰ型花序密集，有50～80朵花;Ⅱ型植株花序疏松，有20～50朵花。由于個別樣品采集到的是植株并未采集到種子，因此采取抽樣法從Ⅰ型的7份材料中抽取4份，Ⅱ型的50份材料中抽取15份，Ⅲ型1份，共計20份材料進行種子形態鑒定。在顯微鏡下對其形態進行觀察和測量，結果表明（圖4），3種類型彎管列當種子在長、寬、大小、形態上均存在差異。Ⅰ型彎管列當種子長267～457 μm，寬121～218 μm，多為卵圓形，Ⅱ型種子長260～578 μm，寬104～360 μm，多為長橢圓形，Ⅲ型種子長236～419 μm，寬141～212 μm，多為倒卵形。種子大小（長×寬）依次為Ⅱ型>Ⅲ型>Ⅰ型，其中，Ⅰ型種子大小顯著小于Ⅱ型（P<0.001），Ⅱ型種子顯著大于Ⅲ型（P<0.001），Ⅰ、Ⅲ型種子大小差異不顯著（P>0.05）。種子長/寬依次為Ⅱ型>Ⅰ型>Ⅲ型，其中Ⅰ、Ⅱ型種子長/寬顯著大于Ⅲ型（P<0.001），Ⅰ型種子長/寬顯著小于Ⅱ型（P<0.001），表明Ⅱ型彎管列當種子最為瘦長。

掃描電鏡結果表明（圖5），3種類型彎管列當種子的表面均呈網狀紋飾，但網紋形狀、網脊粗細、網眼凹陷程度均有細微差異。其中，Ⅰ型彎管列當種子多為卵圓形，種臍收縮褶皺，但種臍端較平，網脊深，種皮有脊狀突起的卵圓形網狀紋飾，網紋里有形狀規則的蜂巢狀凹點小網眼;而Ⅱ型彎管列當種子多為長橢圓形，明顯比Ⅰ、Ⅲ型種子細長，種臍明顯收縮褶皺呈錐形，網脊光滑、突起明顯，脊之間凹陷形成縱矩形大網狀紋飾，網紋里有分布密集的蜂巢狀凹點小網眼，與Ⅰ型相比網眼凹陷較深。Ⅲ型彎管列當種子多為倒卵形，與Ⅰ型較為相似，種臍收縮褶皺，方形網狀紋飾網紋里有形狀規則的小網眼。

3 討論

3.1 基于ITS2序列和種子形態學鑒定的彎管列當遺傳多樣性分析

DNA條形碼技術具有操作簡單、準確度高、不受環境和物種等因素限制、方法通用性強等優勢，是分析群體遺傳多樣性的常用技術之一[21]。Ahmed等[23]利用rbcL、matK條形碼對巴基斯坦俾路支省不同地區采集的15個列當屬樣品進行遺傳分化鑒定，發現matK在列當物種鑒定中的表現優于rbcL，也可作為其他植物物種鑒定的候選基因。Schneeweiss等[24]采用ITS條形碼對全寄生列當科的系統發育和種內變異進行遺傳多樣性分析，結果表明列當科分為兩個譜系，ITS的種內變異低與種內形態變異性、寄主范圍均無關。本試驗利用DNA條形碼技術對中國向日葵主產區采集的58份彎管列當進行rbcL、matK、ITS2片段擴增和比對分析，發現僅ITS2條形碼適用于彎管列當種群遺傳多樣性分析。基于ITS2條形碼聚類結果表明我國不同彎管列當種群也不是單系的，聚為3類，與上述研究結果一致。在本試驗中，matK基因擴增及測序成功率較低（17%），可能與該基因擴增時通用引物有效性較差有關。雖然rbcL在擴增和測序成功率上能達到100%，但該基因序列在彎管列當中保守性高，進化速率較慢，種內差異極小，不適合作為DNA條形碼序列對彎管列當進行種群遺傳分化研究。

目前，彎管列當和向日葵列當O.cumana的命名較混亂，兩個名字在文獻中都有記載。石必顯等[27]利用ISSR標記對我國不同省區的向日葵列當進行遺傳聚類，結果表明可被聚成兩個亞組，其中河北、山西和陜西種群聚成一個亞組，吉林、內蒙古和新疆種群聚成另外一個亞組。本研究中ITS2條形碼聚類結果與石必顯等研究結果有相同之處，我國不同彎管列當種群大致按照地理分布聚為3類。總體上來自相鄰地區的樣品聚類在一起，地理分布越近，親緣關系往往越近，但也存在個別差異，比如采自吉林省同一田間的樣品（JL4、JL6、JL8和JL5、JL7、JL9）呈現復雜類群聚為2類（Ⅰ型、Ⅱ型）。內蒙古地區和新疆地區是我國主要向日葵種植區[3]，以食葵種植為主，種子多采用抗性品種及國內外雜交引種，在向日葵栽培歷史悠久、播種面積大、種源復雜的情況下寄主已經對彎管列當做出了選擇，因而彎管列當種類很單一，聚為一類。而吉林地區列當種群聚為2類可能是由于近年來彎管列當危害嚴重[28]，向日葵種植面積大幅下降，主要以種植當地的傳統品種為主，因此可能篩選出等級較低的列當生理小種，從而呈現復雜類群;也可能是當地種子調運時攜帶列當種子、列當種內存在基因交流以及寄主（向日葵栽培品種）不同，列當出現不同等級進化有關。

本研究所采集的彎管列當植株形態存在明顯差異，其中Ⅰ型植株花序密集，有50～80朵花，花冠藍色或紫色，而Ⅱ型植株穗狀花序松散，有20～50朵花，花冠白色或淡藍色，與Pujadas-Salvà等[13]對列當屬的形態分類研究結果一致。種子掃描電鏡結果表明3種類型彎管列當在種子大小、形狀、種臍、種皮網紋、網眼等微觀形態結構方面存在細微差別，與王定國等[12]的研究結果一致。不同彎管列當種群在植株形態、種子微觀形態存在差異可能與不同環境條件下表型的變異、生理小種的進化有關。

近年來，隨著我國向日葵大面積種植、引種混亂、檢疫滯后、人類活動等因素影響，大部分向日葵種植區受到根部全寄生雜草彎管列當的嚴重威脅[34]。我國不同向日葵種植區彎管列當的遺傳多樣性可以歸因于基因交流和地理生態環境等。此外，不同的寄主栽培品種、氣候環境、土壤條件、人為活動等都可能影響彎管列當種群的表型及遺傳結構變異。

3.2 3種類型彎管列當與國內外彎管列當的親緣關系

彎管列當隨著向日葵的廣泛種植逐漸在世界各地蔓延。調查表明，本研究Ⅰ型彎管列當（北京、河北、吉林JL4、JL6、JL8）只在我國小面積向日葵種植區發生;Ⅱ型彎管列當（新疆、內蒙古、吉林部分地區）分布區是我國向日葵的主產區，同時也是彎管列當危害最嚴重的地區;Ⅲ型（內蒙古開魯縣NM1）介于Ⅰ型、Ⅱ型之間，可能是二者基因交流的結果。基于NCBI數據庫中的ITS2序列構建的系統進化樹表明，我國Ⅰ型、Ⅲ型彎管列當與世界大部分地區（美國、西班牙、格魯吉亞、澳大利亞）報道的彎管列當ITS2序列親緣關系最近，聚為一類，Ⅱ型與以色列報道的彎管列當ITS2序列聚為一類。以上結果表明我國不同地區彎管列當種群遺傳背景復雜，主要原因可能與向日葵引種、彎管列當種子傳播及種群之間的基因交流有關。此外，由于寄生植物較獨特，存在寄主特異性，它們的種群結構也受到寄主的影響，因此其遺傳變異可能因寄主種類不同而產生分化。

4 結論

本研究結合微觀形態學特征分析，采用ITS2條形碼技術，研究了中國主要向日葵種植區寄生雜草彎管列當種群的遺傳多樣性，發現不同地區彎管列當因生境、寄主（向日葵栽培品種）和遺傳背景不同，形成植株形態和遺傳組成存在顯著差異的3個類群。基于ITS2 條形碼和種子形態學觀察相結合的方法可用于彎管列當種群遺傳多樣性研究。本研究為彎管列當防治提供了重要基因資源，為相關向日葵抗性育種奠定了理論基礎。

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（責任編輯：楊明麗）