重慶地區辣椒疫霉交配型分布及對烯酰嗎啉的敏感性現狀

張世才 李怡斐 王春萍 楊小苗 段敏杰 黃任中 黃啟中

摘要 為明確重慶地區辣椒疫霉Phytophthora capsici交配型分布及對烯酰嗎啉的敏感性情況，對2019年-2020年分離的辣椒疫霉進行交配型和敏感性測定。研究發現重慶地區存在A1和A2兩種交配型，且兩者在大部分地區同時存在，測定的102株菌株中，24株菌株為A1交配型，78株為A2交配型，2種交配型的發生頻率分別為23.53%和76.47%。采自重慶潼南、巴南、石柱等地的102株辣椒疫霉菌株對烯酰嗎啉的敏感性測定結果顯示，其EC50分布在0.107 5～0.438 3 μg/mL之間，最不敏感菌株是最敏感菌株的4.1倍，平均EC50為（0.296 2±0.005 3）μg/mL。102株菌株對烯酰嗎啉的敏感性分布呈單峰曲線，未出現抗藥性病原菌亞群體。

關鍵詞 辣椒疫霉; 交配型; 烯酰嗎啉; 敏感性

中圖分類號： S436.418.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021295

Abstract In order to clarify the mating type distribution of Phytophthora capsici and its sensitivity to dimethomorph in Chongqing， the mating types and sensitivity of P.capsici isolated in 2019-2020 were determined. The results showed that there were two mating types （A1 and A2） in Chongqing， and they existed in most areas at the same time. Among 102 isolates， 24 were A1 mating type and 78 were A2 mating type. The frequencies of two mating types were 23.53% and 76.47%， respectively. Their sensitivity to dimethomorph was tested， and the results showed that their EC50 values ranged from 0.107 5 to 0.438 3 μg/mL， with an overall mean of （0.296 2±0.005 3） μg/mL. The EC50 value of the most insensitive strain was 4.1 times of that the most sensitive strain.The distribution curve of sensitivity frequencies of P.capsici to dimethomorph was unimodal， and there was no resistant subpopulation among these isolates.

Key words Phytophthora capsici; mating type; dimethomorph; sensitivity

由辣椒疫霉Phytophthora capsici侵染引起的疫病是辣椒生產上的一種毀滅性土傳病害，在世界各地辣椒種植區均有發生[1]。P.capsici屬于異宗配合的卵菌，兩種不同的交配型菌株相互誘導才能發生有性生殖，產生的卵孢子具有更強的致病性、抗逆能力以及更廣泛的寄主植物[2]。有性生殖也是疫霉等植物病原菌遺傳變異的重要來源，因此，研究辣椒疫霉的交配型及分布，對辣椒疫霉的起源與演化、疫病發生規律及抗性育種材料的篩選等有重要意義。

在生產上，辣椒疫病的防治主要以培育抗病品種和化學藥劑為主[3]。烯酰嗎啉（dimethomorph）是一種羧酸酰胺類的內吸性殺菌劑，對霜霉屬Peronospora和疫霉屬Phytophthora卵菌病害具保護和治療作用，與苯基酰胺類殺菌劑無交互抗性[45]。當前，羧酸酰胺類殺菌劑已經在多種卵菌病害如辣椒疫病、番茄晚疫病、瓜類霜霉病等病害的防治中廣泛應用[6]。隨著藥劑使用量的不斷加大，辣椒疫霉的抗藥性風險也逐年升高。近年來，有關辣椒疫霉對羧酸酰胺類殺菌劑的抗藥性已有一些研究[67]，但未見重慶地區的相關報道。

對重慶地區辣椒疫霉的交配型組成以及烯酰嗎啉的抗藥性水平的研究，旨在了解重慶地區辣椒疫霉有性生殖在病原菌遺傳多樣性和致病性分化中的作用及抗藥性程度，為辣椒疫霉抗藥性治理及化學殺菌劑的選擇和綠色防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

2019年-2020年從重慶潼南、巴南、合川、石柱等辣椒主產區采集具有典型癥狀的病葉和病果樣品，分離、純化獲得辣椒疫霉菌株102株，分離純化用加有抗生素的選擇性燕麥培養基，其配方和配制參照鄭小波[8]的方法。

1.1.2 標準菌株

標準菌株A1交配型（P991）和A2交配型（P731）由南京農業大學提供。

1.1.3 供試培養基

10% V8 培養基：將100 mL V8蔬菜汁、0.2 g CaCO3、900 mL去離子水和18 g瓊脂粉置于三角瓶中，充分搖勻后，高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min。

燕麥培養基：取燕麥片30 g放入l 000 mL的燒杯中，加入500 mL去離子水，沸水浴加熱1 h后雙層紗布過濾;稱取18 g瓊脂粉加入適量去離子水，溶化后與濾液充分混合，定容至1 000 mL后趁熱分裝，高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min。

1.1.4 供試藥劑

96.8%烯酰嗎啉原藥，由安徽豐樂農化有限責任公司提供，將原藥溶于二甲基亞砜（DMSO），配制成1×104 μg/mL母液，置于4℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 交配型測定

交配型測定采用直接配對法[9]。供試菌株和標準菌株分別在燕麥培養基上培養7 d后，用直徑5 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，將A1、A2標準菌株分別與供試菌株對峙接種在V8平板上，每個培養皿平行排2列，每列放置3塊菌餅，兩列菌餅間距4～5 cm。平板置于25℃恒溫箱中黑暗培養10 d后，將培養皿倒置在顯微鏡載物臺上，10×10倍視野下檢查菌落交界處及周圍是否產生藏卵器、雄器及卵孢子。每處理設置3個重復，測定試驗重復2次。

待測菌株交配型的確定按照以下標準[2，8]：僅與A1交配型菌株配對產生卵孢子的為A2交配型;僅與A2交配型菌株配對產生卵孢子的為A1交配型;與A1和A2交配型菌株配對均不產生卵孢子的為A0交配型;單獨培養或自身配對即可產生卵孢子的為A1A2交配型;與A1和A2交配型菌株配對均產生卵孢子，但是單獨培養或自身配對都不產生卵孢子的為A1，A2交配型。

1.2.2 辣椒疫霉對烯酰嗎啉的敏感性測定

先進行預試驗，將待測菌株轉接至烯酰嗎啉濃度為0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL的V8培養基平板中培養6 d，根據菌落的生長情況確定烯酰嗎啉的濃度梯度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL。待測菌株在V8培養基上25℃黑暗條件下培養5 d后，用打孔器（直徑5 mm）在菌落外緣同一圓周上打取菌餅，分別接種到含系列濃度的烯酰嗎啉V8培養基平板上，以只含等量二甲基亞砜的V8培養基平板作為對照，置25℃黑暗條件下培養6 d。采用十字交叉法測量處理菌落的直徑，每個處理重復3次。求出每個藥劑濃度對菌絲生長的抑制率，生長抑制率=（對照菌落的增長直徑-藥劑處理菌落的增長直徑）/對照菌落增長直徑×100%。計算抑制率的幾率值，求出毒力回歸方程y=a+bx，根據毒力回歸方程計算烯酰嗎啉的有效抑制中濃度EC50（μg/mL）和相關系數r值。

2 結果與分析

2.1 交配型測定

對分離保存的102株菌株進行交配型測定，結果顯示（表1）：78株為A2交配型，發生頻率為76.47%，其余24株為A1交配型，發生頻率為23.53%，未檢測到其他交配型。可見，辣椒疫霉在重慶地區以A2交配型為主。在12個辣椒產區中，A1和A2兩種交配型在其中10個產區同時存在，且兩種交配型在不同地區的發生頻率也不同。

2.2 辣椒疫霉對烯酰嗎啉的敏感性測定

測定結果表明（表2）：采自重慶潼南、巴南、合川及石柱等地區的102株辣椒疫霉菌株對烯酰嗎啉的EC50介于0.107 5～0.438 3 μg/mL之間，平均值為（0.296 2±0.005 3）μg/mL，最不敏感菌株的EC50為最敏感菌株的4.1倍。所有菌株對烯酰嗎啉的敏感性分布呈連續性單峰曲線（圖1），總體來看，接近正態分布，未出現敏感性顯著下降的病原菌亞群體。

對菌株敏感性分析表明，不同地區和同一地區的不同菌株對烯酰嗎啉的敏感性有一定的差異。其中，巴南區12個菌株的EC50平均值最低，為0.259 3 μg/mL，分布范圍為0.107 5～0.338 1 μg/mL;璧山區12個菌株的 EC50平均值最高，為0.340 4 μg/mL，分布范圍為 0.276 4～0.430 5 μg/mL。雖然巴南區菌株的EC50平均值最低，但是其最高 EC50為最低的3.15倍，在所有測定地區中最高。

3 結論與討論

關于辣椒疫霉的交配型，2012年-2014年的相關研究表明[1012]，江西、安徽和青海的交配型均以A2為主，其中，江西省未發現其他交配型;安徽省A2交配型占90.6%，A1交配型占9.4%;青海省A2交配型占61.9%，A1交配型占33.3%，A0交配型占4.8%。2008年劉永剛等[13]研究認為甘肅省辣椒疫霉存在A1、A2和A0三種交配型，以A1和A0占優勢;2009年楊明英等[14]報道了云南省疫霉菌株由A1、A2和A1A2三種類型組成，以A2和A1A2交配型為主。本研究中，重慶地區存在A1和A2兩種交配型，A2交配型占76.47%，A1交配型占23.53%，未檢測到其他類型，這一結果與江西、安徽和青海的分布相似，都以A2交配型為主，但不同地區之間交配型的發生頻率又各不相同。可以看出，辣椒疫霉在我國有豐富的遺傳多樣性，其交配型呈不均等分布。本研究測定重慶的12個辣椒產區中，兩種交配型共存的產區有10個，所有產區的交配型均以A2為主，這表明重慶地區辣椒疫霉能夠完成有性生殖過程，產生的卵孢子有助于病原越冬存活，將大大提高疫病的發生頻率。另外，有性生殖過程可通過基因重組提高病原的遺傳變異幾率，導致致病力和遺傳多樣性分化，增加病害防治的難度。

在我國，烯酰嗎啉用于霜霉病、疫病等卵菌病害的防治已有20余年，隨著烯酰嗎啉等羧酸酰胺類殺菌劑使用量的不斷增大，病原的抗藥性問題引起了科研人員的極大關注。2009年崔曉嵐等[6]對采自河北、內蒙古和陜西等地的125株辣椒疫霉菌株進行烯酰嗎啉敏感性測定，結果表明未出現抗性的病原菌亞群體，其EC50在0.126～0.318 μg/mL之間，最不敏感菌株是最敏感菌株的2.5倍，平均EC50為（0.218±0.036 8）μg/mL;2010年Sun等[15]對采集自江蘇、遼寧、安徽等地未接觸過羧酸酰胺類殺菌劑的90株辣椒疫霉開展敏感性測定，結果顯示EC50范圍為0.122～0.203 μg/mL，最不敏感菌株是最敏感菌株的2倍，EC50平均值為（0.154±0.022）μg/mL。本研究中，重慶地區辣椒疫霉的平均EC50（0.296 2 μg/mL）、最大EC50（0.438 3 μg/mL）及最不敏感菌株是最敏感菌株的倍數值（4.1倍），與崔曉嵐和Sun等的研究結果相一致。可見，目前重慶地區的辣椒疫霉對烯酰嗎啉還沒有產生抗藥性。烯酰嗎啉具有多個作用位點，由于抗藥性機理復雜，盡管國內已使用多年，至今還未見從大田中檢測到疫霉抗性菌株的報道，但有一些通過室內誘變抗性突變體的研究。崔曉嵐等[6]通過室內紫外誘變辣椒疫霉，獲得13個烯酰嗎啉的抗性突變體，其中1個突變體菌株的抗性指數高達680倍;Sun等[15]獲得了4個抗性突變體菌株，其中1個突變體菌株抗性指數高達1 200倍;Bagirova等[16]采用化學誘變和二次紫外線照射誘導致病疫霉游動孢子，篩選出了低水平抗藥性菌株突變體;Stein等[17]研究得出抗烯酰嗎啉突變體菌株在生長速率和致病性方面有下降的趨勢，認為突變體在自然環境中很難發展成優勢群體。可見，辣椒疫霉對烯酰嗎啉存在一定的抗藥性風險，至于某些抗性突變體菌株出現的生長速率和致病性下降情況，還有待進一步研究。在大田使用過程中應盡可能減少烯酰嗎啉的使用頻率及用量，注意與嘧菌酯、霜霉威等不同作用機理的藥劑混配或輪換使用[1819]，并繼續開展抗藥性監測工作。

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（責任編輯：田 喆）