浙貝母灰霉病病原真菌的分子鑒定

李吉二 溫思思 張羽加 金洛稼 趙偉春

摘要 為了鑒定引起浙貝母Fritillaria thunbergii Miq. 灰霉病的病原真菌，于2015年-2019年收集浙貝母灰霉病樣品，采用常規組織分離法在PDA培養基上分離純化獲得10株葡萄孢屬Botrytis真菌。進一步以內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）、RNA聚合酶亞基Ⅱ（the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzyme Ⅱ，RPB2）、熱激蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，G3PDH）為DNA條形碼，用特異性引物進行PCR擴增并測序，運用CodonCode Aligner拼接序列及BLAST分析，這10個菌株序列相同，為同一菌株，在GenBank中進行同源性比對，用MEGA 10.1構建系統發育樹，確定此菌株與灰葡萄孢Botrytis cinerea相應序列的一致性為100%。盆栽接種法檢測表明此菌株可引起浙貝母灰霉病。據此認為浙貝母灰霉病的病原真菌是灰葡萄孢而非普遍認為的橢圓葡萄孢Botrytis elliptica。

關鍵詞 浙貝母; 灰霉病; 病原真菌; 灰葡萄孢; 分子鑒定

中圖分類號： S435.672

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021091

Abstract In order to identify the pathogenic fungi causing grey mold on Fritillaria thunbergii Miq.， the disease samples were collected from 2015 to 2019， conventional tissue isolate method was used to isolate and purify the pathogen from samples on PDA medium and the ten isolates belonging to Botrytis were obtained. The specific sequence of ITS （internal transcribed spacer）， RPB2 （the second largest subunit of the nuclear RNA polymerase enzymeⅡ）， HSP60 （heat shock protein 60） and G3PDH （glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase） were used as DNA barcode. They were amplified by PCR and sequenced， respectively. The sequences were spliced using CodonCode Aligner software and then BLAST analysis was carried out. These ten isolates are same strain with same sequence. The sequences were aligned in GenBank， and the phylogenetic trees were constructed using MEGA 10.1 software. The results showed that this strain shared 100% identity with Botrytis cinerea. The pathogenicity test by in vivo pot inoculation revealed that this strain can cause gray mold disease on F.thunbergii. Therefore， the pathogenic fungus causing mold disease of F.thunbergii is B.cinerea rather than B.elliptica， which was generally believed.

Key words Fritillaria thunbergii; grey mold disease; pathogenic fungus; Botrytis cinerea; molecular identification

浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.為百合科Liliaceae貝母屬Fritillaria多年生草本植物，著名的“浙八味”之一。目前在浙江、江西、湖南、江蘇和安徽大面積栽培，是當地農民收入的主要來源[1]。然而，隨著種植面積的不斷擴大，重茬和鱗莖營養繁殖，浙貝母病害發生日益突出，其中以灰霉病危害最重，高發年病株率達82%以上[23]，2017年，2018年，2020年浙江省磐安縣浙貝母灰霉病普遍發生，部分田塊全田枯死，藥農普遍稱之為“難治之癥”，每年給種植戶造成10%～30%的損失[12，45]。

浙貝母灰霉病，也稱“早枯”“青塌腐”“眼圈病”。葉、莖、花、果實均能受害，以葉片的癥狀最為明顯，葉片染病，有時病斑上長出灰色霉狀物，殘留在田間的菌核、菌絲體和分子孢子是次年灰霉病發生的主要侵染來源[1， 3， 6]。李云山等采用形態學觀察法將引起此病的病原鑒定為橢圓葡萄孢Botrytis elliptica（Berk.）Cooke[7]。宗侃侃等則認為浙貝母灰霉病的致病菌是灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers[1]，但未對其進行鑒定。至今未見有利用分子生物學技術對浙貝母灰霉病的致病菌進行準確分類鑒定的報道。Staats等利用RPB2、HSP60、G3PDH等3個核基因分析了葡萄孢屬Botrytis 23個種（包括1個雜交種）及其寄主的進化關系[8]。為了明確浙貝母灰霉病致病菌的種類，本研究從浙江省磐安縣獲得浙貝母灰霉病病株并從中分離純化病原菌，通過觀察癥狀、菌落及孢子形態，并采用DNA條形碼技術[9]結合致病性檢測對其致病菌進行分類鑒定，為浙貝母灰霉病的監測和防治及生物學研究提供理論和試驗依據。gzslib202204041314

1 材料與方法

1.1 材料

浙貝母灰霉病植株：自2015年-2019年連續5年從浙江省磐安縣冷水鎮白巖村、新渥鎮彈上村等浙貝母栽培基地采集葉片褪綠黃化，呈水浸狀斑塊或莖稈表面褐變濕腐，病斑上有灰色霉層等[1]疑似浙貝母灰霉病病株8株，帶回實驗室用于病原真菌的分離，記錄采集時間、采集地點、樣品編號和病害癥狀。

對病原菌的ITS、RPB2、HSP60、G3PDH基因擴增和測序。所用通用引物序列及PCR反應條件參考文獻[1013]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分離純化

采用常規組織分離法[1415]分離純化浙貝母灰霉病病原真菌。病株經清水、無菌水沖洗后用75%乙醇浸泡1 min，1%NaClO溶液消毒5 min，再用75%乙醇漂洗50 s，最后用無菌水清洗。無菌條件下剪成5 mm×3 mm左右的組織塊，放在PDA培養基平板上，置于23℃恒溫培養箱中倒置培養。3～5 d后，觀察菌落生長情況。用無菌接種環挑取組織塊周圍長出的菌絲，在PDA上繼代培養分離菌株，直到獲得單一菌落。用直徑為1 cm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，浸入70%甘油，-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 病原真菌形態學鑒定

觀察菌落的大小、質地、顏色和生長速度等培養性狀，利用光學顯微鏡（YS100型，Nikon）觀察純化菌株的菌絲形態、孢子特征等顯微形態[14]，并且進行分類、編號及保存備用。

1.2.3 病原真菌DNA的提取

取培養4～6 d的菌絲體30 mg于2 mL離心管中，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（Sangon Biotech）提取病原菌基因組DNA，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.2.4 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測

采用真菌rDNA-ITS的通用引物及G3PDH、HSP60、RPB2的特異性引物對基因組DNA進行PCR擴增（PCR自動系列分析儀 Tpersonal型，Biometra）。PCR反應體系（25 μL）：2×Taq MasterMix 12.5 μL，0.1 mmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件見表2。取5 μL PCR產物，60 V恒壓下在1%瓊脂糖凝膠中電泳50 min，凝膠成像系統（Tanon-2500型，天能）觀察DNA擴增情況。

1.2.5 PCR產物測序拼接

PCR產物由江蘇金唯智生物科技公司進行雙向測序。測序結果用Codoncode Aligner軟件進行拼接。

1.2.6 序列的同源性比對及系統發育樹的構建

拼接后的序列在GenBank數據庫（http：∥blast.ncbi. Nlm. Nih.gov/）中對葡萄孢屬真菌的ITS、RPB2、HSP60和G3PDH序列進行BLAST多序列比對。利用MEGA 10.1軟件構建系統發育樹，用1 000次重復bootstrap檢驗系統發育樹各分支的支持率，以支持率≥50%為閾值作為成功鑒別物種的界限[16]。

1.2.7 病原菌的致病性檢測

采用活體盆栽接種法：選6株健康的浙貝母植株，移栽到實驗室內用無菌土培養7 d適應環境。將從病株上分離純化并培養了5 d的菌株打成直徑6 mm的菌餅兩個，加入到50 mL無菌水中，用滅菌玻璃棒將菌餅碾碎，使菌絲團徹底散開，每株浙貝母澆灌50 mL菌懸液。同時以接種空白PDA的植株為對照。根據分子鑒定結果，10個分離物為同一菌株，故設接菌和不接菌2個處理，每個處理重復3組。接種后的植株于室溫培養，觀察、記錄植株發病情況，并從發病部位再次分離病原真菌，確定分離得到的病菌是否為同一病菌。

2 結果與分析

2.1 浙貝母灰霉病的田間癥狀觀察

發病初期，浙貝母葉片上出現淡褐色的小斑點，逐漸擴大成橢圓形或不規則的黃褐色病斑，邊緣有明顯的水漬狀環，不斷擴大形成灰色大斑，病株葉片略微黃色，有許多黑色斑塊。發病后期可見整個植株枯死（圖1）。潮濕時病部表層會產生大量的灰色霉層，上面分生孢子梗及分生孢子清晰可見。

2.2 病原真菌的顯微觀察

分離獲得10個真菌菌落，觀察各菌落在培養基上的形態與顯微結構，均表現出葡萄孢盤菌屬真菌的顯著特征。菌落為近圓形，菌落正面內圈為褐色，外圈為淡褐色，背面呈淡褐色（圖2）;菌落初期為灰白色，菌絲生長旺盛，平均生長速率約為12 mm/d，后期培養基邊緣長出圓形的或者規則的灰黑色菌核，菌落表面也有菌核產生，并常伴有水珠樣分泌物;菌絲有隔，不規則分支，分生孢子梗清晰可見，分生孢子單生，球形或近球形，單孢（11.25～15.00）μm×（6.25～8.75）μm（平均13.13 μm×7.50 μm）。根據其形態特征初步鑒定為葡萄孢盤菌屬真菌[14]。

2.3 病原真菌DNA的PCR擴增、測序、拼接及同源序列一致性比對

用真菌rDNA-ITS、RPB2、HSP60和G3PDH引物從10個分離物DNA中均成功獲得相應序列。用Codoncode Aligner 軟件對各分離物的上述序列測序結果進行拼接及BLAST分析，發現這10個分離物的序列相同，為同一菌株。將序列上傳至GenBank獲得序列登錄號。分離物的ITS序列（登錄號：MN243672，521 bp）與GenBank中登錄號為KT279813的灰葡萄孢和登錄號為AB828687的富氏葡萄孢盤菌Botryotinia fuckeliana （灰葡萄孢的有性型）的一致性為100%;RPB2序列（登錄號：MN386055，1 143 bp）與登錄號為MG846509、KX867998的灰葡萄孢一致性為99.74%和登錄號為KJ018755的富氏葡萄孢盤菌一致性為99.46%;HSP60序列（登錄號：MN386077，1 022 bp）與登錄號為MK791187、MT233447、MH713609、MN159921的灰葡萄孢和登錄號為KC620329、JN692388富氏葡萄孢盤菌的一致性為99.80%;G3PDH序列（登錄號：MN386066，968 bp）與登錄號MN448500、MK791186、MK296119的灰葡萄孢和登錄號為KJ018759的富氏葡萄孢盤菌的一致性為99.90%。gzslib202204041314

2.4 系統發育樹的構建

基于ITS、RPB2、HSP60、G3PDH基因序列的系統發育樹如圖3所示。分離物的ITS序列與GenBank中灰葡萄孢、富氏葡萄孢盤菌和水仙葡萄孢的有性型Botryotinia narcissicola[17]等3個葡萄孢盤菌屬真菌聚為一大支。分離物的RPB2基因序列先與灰葡萄孢及其有性型聚為一小支，然后與蔥腐葡萄孢Botrytis aclada聚為一支。分離物的HSP60基因序列與灰葡萄孢及其有性型聚為一支。分離物的G3PDH基因序列與灰葡萄孢及其有性型聚為一大支。因此，通過對各分離物ITS、RPB2、HSP60、G3PDH序列分析并結合形態學特征，鑒定分離物為灰葡萄孢。

2.5 病原菌的致病性檢測

經致病性檢測，無菌土澆淋菌懸液1周后，浙貝母植株出現典型的灰霉病癥狀（圖4）：葉片褪綠發黃，葉片上有水浸狀斑塊。所以該分離物可引起浙貝母灰霉病，是引起浙貝母灰霉病的病原菌。

3 討論

以往多數報道認為，浙貝母灰霉病由橢圓葡萄孢侵染所致[4，67，18]，但文獻資料均是通過病原真菌的菌落、菌絲體、分生孢子、分生孢子梗等形態學特性進行鑒定，未見有利用分子生物學技術對其進行分類鑒定。宗侃侃等認為其致病菌可能為灰葡萄孢，但未提供分類鑒定的試驗依據[1]。本實驗室歷時數年從浙江省磐安縣采集浙貝母灰霉病病株，并經多次分離純化，獲得了10株葡萄孢屬真菌，并首次采用國際通用的rDNA-ITS、HSP60、G3PDH和RPB2序列作為DNA條形碼結合致病性測定，證明了灰葡萄孢是浙貝母灰霉病的一種致病菌。

本實驗室從2015年—2019年采集的浙貝母灰霉病病樣中均未獲得橢圓葡萄孢。究其原因，可能是由于橢圓葡萄孢的菌落、菌絲和孢子形態與葡萄孢盤菌的近緣種相似，以往觀察到的可能并非橢圓葡萄孢，或是由于種植方式、氣候、地域等條件的改變使浙貝母灰霉病的致病菌種類發生了變化。以往通過生物學特性研究，將同為百合科的百合灰霉病病原真菌鑒定為橢圓葡萄孢[1920]，但近年來利用DNA條形碼技術鑒定的結果證明，百合灰霉病的致病菌亦為灰葡萄孢[2122]。分子生物學技術避免了形態學鑒定方法不易區分近緣種的問題，能更準確地鑒定真菌的種類。橢圓葡萄孢是否為浙貝母灰霉病的致病菌仍有待于進一步研究。

因此，本研究首次證實了浙貝母灰霉病的致病菌為灰葡萄孢，這為浙貝母灰霉病的流行學研究、動態監測及防治奠定了基礎。

參考文獻

[1] 宗侃侃， 石紅靜， 陳淑淑， 等. 浙貝母灰霉病發生流行因子分析及綜合防治技術[J]. 浙江農業科學， 2018， 59（9）： 15471549.

[2] 佚名. 浙貝母灰霉病的發生情況及其防治初報[J]. 中藥材科技， 1981（1）： 1517.

[3] 趙永根. 貝母灰霉病發生特點與綜合防治技術的研究[J]. 現代中藥研究與實踐， 2007， 21（4）： 89.

[4] 呂先真， 鄭永利， 潘蘭蘭， 等. 浙貝母主要病害及其綜合防治[J]. 安徽農學通報， 2006， 12（2）： 8586.

[5] 韋傳寶， 劉林帥， 鄭淼淼. 藥用貝母栽培中病蟲鼠害發生情況及防治措施[J]. 湖南農業科學， 2011（12）： 101104.

[6] 趙培潔. 濕熱條件對貝母灰霉病菌核存活的影響[J]. 中藥材， 1990（12）： 89.

[7] 李云山， 鄭成. 浙貝母灰霉病病菌的生物學特性研究[J]. 浙江農業大學學報， 1984（3）： 5363.

[8] STAATS M， VAN BAARLEN P， VAN KAN J A L. Molecular phylogeny of the plant pathogenic genus Botrytis and the evolution of host specificity [J]. Molecular Biology and Evolution， 2005， 22（2）： 333346.

[9] 張艷杰， 沈鳳英， 許換平， 等. 灰葡萄孢多樣性研究進展[J]. 農業生物技術學報， 2017， 25（6）： 954968.

[10]徐云飛， 祁依佳， 溫思思， 等. 浙貝母黑斑病致病菌的分離鑒定及分子檢測[J]. 浙江中醫藥大學學報， 2020， 44（2）： 111118.

[11]DENTON A L， MCCONAUGHY B L， HALL B D. Usefulness of RNA polymerase Ⅱ coding sequences for estimation of green plant phylogeny [J]. Molecular Biology and Evolution， 1998， 15（8）： 10821085.

[12]胡玉山， 王鳴， 杜琳， 等. hsp60基因序列分析及其在病原菌鑒定中的應用[J]. 中華微生物學和免疫學雜志， 2007， 27（9）： 851855.

[13]盧倩， 弭曉菊， 崔繼哲. 植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶作用機制的研究進展[J]. 生物技術通報， 2013（8）： 16.

[14]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海： 科學技術出版社， 1979.

[15]陸家云. 植物病原真菌學[M]. 北京： 中國農業出版社， 2001.

[16]郭靜， 王超， 張宏彬， 等. 系統發生樹構建方法綜述[J]. 計算機應用研究， 2013， 30（3）： 647655.

[17]張忠義. 中國真菌志：第26卷[M]. 北京： 科學出版社， 2006： 3756.

[18]呂先真， 潘蘭蘭， 黃海叁， 等. 8種藥劑對浙貝母灰霉病、黑斑病的防治效果實驗[J]. 農藥科學與管理， 2004， 26（2）： 2628.

[19]唐祥寧， 肖愛萍， 游春平， 等. 百合灰霉病病菌生物學特性研究[J]. 江西農業大學學報， 1998， 20（4）： 7781.

[20]白濱， 楊花蓮， 何蘇琴， 等. 蘭州百合葉枯病病原菌形態特征及生物學特性研究[J]. 中國蔬菜， 2013（16）： 7884.

[21]CAO Xiaoqian， SHI Shaochuan， ZHANG Zhao. First report of Botrytis leaf blight on lily （Lilium longiflorum） caused by Botrytis cinerea in Beijing， China [J]. Plant Disease， 2018， 102（5）： 10331034.

[22]杜艷麗， 曹興， 王桂清， 等. 百合灰霉病病原菌鑒定及其部分生物學特性測定[J]. 南方農業學報， 2019， 50（2）： 307314.