NOD2、TLR4、Foxp3 與慢阻肺急性加重期患者Th1/Th2 免疫應答的相關性分析

王曦，張偉，姚春艷

1.合肥市第二人民醫院檢驗科，安徽合肥 230011；2.滁州市鳳陽縣疾病預防控制中心衛生科，安徽滁州 233100

慢阻肺屬于世界范圍中排名第四的致死性疾病，由免疫反應致使出現肺實質、氣道和肺血管等特征的一種疾病[1]。該病發展趨勢呈進行性，常在老年人群中較為常見。慢阻肺急性加重期為慢阻肺在自然病程中出現的急性事件，當慢阻肺疾病進展為急性加重期，將顯著降低患者生活質量、增加醫療費用[2]。因此，為能夠更好地認識急性加重期慢阻肺異質性、改善患者預后與疾病轉歸、提供較為合理及有效的治療方案，探究慢阻肺急性加重期患者相關機制具有重要意義[3]。相關研究顯示，免疫反應失衡以及炎癥反應是導致慢阻肺呈持續性發生并呈進行性加重的主要原因[4]。本文選擇探究NOD 樣受體2(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)、TOLL 樣 受 體4(toll-like receptor 4,TLR4)、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(forhead/winged helix transcription factor, Foxp3)與慢阻肺急性加重期患者Th1/Th2 免疫應答的相關性。現分析2019 年5月—2020 年5 月合肥市第二人民醫院收治的慢阻肺急性加重期患者86 例的臨床資料，對其進行研究。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的慢阻肺急性加重期患者86 例為慢阻肺加重組，出現肺部感染患者44 例，非肺部感染42 例。男44 例，女42 例；年齡52～73 歲，平均（62.5±8.4）歲。另選取同期在本院進行體檢的健康志愿者50 名為健康對照組，男25 名，女25 名；年齡51～72 歲，平均（61.5±8.2）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究所有患者及家屬已經知情同意，且已獲得本院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：患者均符合中華醫學會對慢阻肺相關診斷標準，且患者均為急性加重期[5]。

排除標準：①在妊娠期及哺乳期者；②對本研究所使用藥物不耐受或抵抗者；③資料不齊全者；④合并嚴重心腦血管受損者；⑤合并血液系統及神經系統疾病者；⑥合并過敏性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 表達檢 測 以RT-PCR 對NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 表達進行檢測：提取細胞總RNA，檢測其純度及含量。通過逆轉錄處理獲得cDNA 后設計引物序列。以2-△△Ct 方法計算IRAK-4mRNA，PCR 引物以Primer Premier 6.0 軟件進行設計（Invitrogen 公司合成）。

1.3.2 Th1、Th2 細胞數檢測 所有研究對象均在前1 d 禁食8 h 以上，空腹抽取靜脈血3 mL，對待測標本做抗凝處理，分為兩管，分別加入20 μL Th1、Th2單克隆抗體，在室溫環境下孵育30 min 后在各管中加入融血劑，待其完全溶血后進行離心處理5 min，棄上清液，使用洗滌液對其進行洗滌后在各管中加入150 μL 固定劑，使用0.5 mL PBS 混合均勻制備為懸液，使用流式細胞儀檢測Th1、Th2 水平，并計算Th1/Th2 比值。

1.4 統計方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，符合正態分布的計量資料采用（±s）表示，組間差異比較進行獨立樣本t檢驗，相關性采用Pearson 相關系數（r）表示。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組NOD2mRNA、TLR4mRNA及Foxp3 mRNA表達比較

與健康對照組相比，慢阻肺加重組NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 表達均較高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組研究對象NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 表達對比(±s)

表1 兩組研究對象NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 表達對比(±s)

組別健康對照組（n=50）慢阻肺加重組（n=86）t 值P 值NOD2mRNA 11.16±3.52 50.51±5.43 45.900 0.001 TLR4mRNA 0.43±0.05 1.09±0.12 37.020 0.001 Foxp3mRNA 0.18±0.03 0.54±0.04 55.220 0.001

2.2 兩組Th1、Th2、Th1/Th2 水平比較

與健康對照組相比，慢阻肺加重組Th1、Th2、Th1/Th2 水平均較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組研究對象Th1、Th2、Th1/Th2 水平對比(±s)

表2 兩組研究對象Th1、Th2、Th1/Th2 水平對比(±s)

組別健康對照組（n=50）慢阻肺加重組（n=86）t 值P 值Th1（%）9.16±0.94 4.51±0.47 38.420 0.001 Th2（%）6.43±0.67 2.29±0.23 52.350 0.001 Th1/Th2 14.54±1.52 6.58±0.65 42.430 0.001

2.3 不同肺部感染患者NOD2mRNA、TLR4 mRNA 及Foxp3mRNA 表達比較

與無肺部感染患者相比，出現肺部感染患者NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 表達較高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同肺部感染患者NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA表達對比(±s)

表3 不同肺部感染患者NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA表達對比(±s)

分類無肺部感染（n=42）出現肺部感染（n=44）t 值P 值NOD2mRNA 39.27±4.03 53.53±5.06 14.410 0.001 TLR4mRNA 0.64±0.07 1.13±0.11 24.510 0.001 Foxp3mRNA 0.14±0.02 0.31±0.04 24.740 0.001

2.4 不 同 肺 部 感 染 患 者Th1、Th2、Th1/Th2 水 平比較

與無肺部感染患者相比，出現肺部感染患者Th1、Th2、Th1/Th2 水平均較低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同肺部感染患者Th1、Th2、Th1/Th2 水平對比(±s)

表4 不同肺部感染患者Th1、Th2、Th1/Th2 水平對比(±s)

分類無肺部感染（n=42）出現肺部感染（n=44）t 值P 值Th1（%）4.74±0.49 2.06±0.21 33.230 0.001 Th2（%）3.43±0.35 1.31±0.15 36.800 0.001 Th1/Th2 7.29±0.82 4.52±0.51 18.900 0.001

2.5 NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 與Th1、Th2 相關性分析

NOD2mRNA 與Th1 呈 負 相 關（r=-0.303，P=0.001）；TLR4mRNA 與Th1 呈負相關（r=-0.323，P=0.002）；Foxp3mRNA 與Th1 呈負相關（r=-0.323，P=0.003）。見圖1。

圖1 NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 與Th1 相關性分析

NOD2mRNA 與Th2 呈 負 相 關（r=-0.462，P=0.004）；TLR4mRNA 與Th2 呈負相關（r=-0.299，P=0.005）；Foxp3mRNA 與Th2 呈負相關（r=-0.302，P=0.005）。見圖2。

圖2 NOD2mRNA、TLR4mRNA 及Foxp3mRNA 與Th2 相關性分析

3 討論

慢阻肺為以氣流受限為特征的一種肺部疾病，呈進行性發展。慢阻肺在老年人群中較為常見，隨著我國人口老齡化的加重，慢阻肺發病率呈急劇上升趨勢[6]。慢阻肺急性加重期常指發病過程中患者咳嗽、咳痰、氣短以及喘息等情況在短期內出現急性加重，且痰量較多，呈現膿性或黏膿性[7]。慢阻肺急性加重期能夠導致患者迅速出現肺功能下降及喪失，嚴重影響患者生活質量及預后[8]。目前，關于慢阻肺急性加重期的發病機制尚不明確，多數學者認為，慢阻肺急性加重期與免疫系統及諸多因子調控具有密切聯系[9]。

NOD2 作為NOD 蛋白家族中具有代表性的因子，在人體NOD 蛋白家族中廣泛存在，在遺傳上有著高度的保守性[10]。NOD2 高度參與免疫及炎癥反應，發揮著重要的調控作用[11]。相關研究顯示，NOD2 能夠激活NF-κB 信號通路，參與炎癥反應，進而加重患者病情。因此，當慢阻肺病情加重時，NOD2 表達將會明顯上升[12]。本研究結果發現，在慢阻肺急性加重期中NOD2mRNA 表達為（50.51±5.43），高于健康時水平（11.16±3.52），同時與Th1、Th2 呈負相關（P＜0.05）。有學者研究顯示，NOD2 表達水平從（39.27±4.03）升高至（53.53±5.06），使患者體內炎癥因子水平升高，加重機體炎癥反應，促進慢阻肺的病情發展，其研究與本研究保持一致，表明在慢阻肺急性加重期中，NOD2 與慢阻肺急性加重期進展過程密切相關，與免疫應答降低有關。

在慢阻肺急性加重期進展過程中T 細胞亞群在其中有著明顯參與，而Foxp3 為調控T 細胞分化及功能的關鍵因子[13]，其能夠在一定程度上調控CD4+及CD25+的表達，從而調控T 細胞分化、活化等，抑制免疫應答[14]。相關研究顯示，在肺癌組織中，Foxp3 可能參與生成、發展、遷移，同時是造成免疫逃逸的一種關鍵因子[15]。本研究結果發現，在慢阻肺急性加重期中Foxp3mRNA 表達較高，同時與Th1、Th2 呈負相關。有學者研究顯示，慢阻肺患者體內存在免疫功能失調，Foxp3 抑制免疫系統中的免疫細胞，導致慢阻肺的發生、發展，其研究與本研究結果保持一致，表明Foxp3 與慢阻肺急性加重期進展過程密切相關，與免疫應答降低有關。

TLRs 是生物細胞對外界信息的感受器,能構成免疫識別系統，在機體免疫系統的抗炎過程中發揮重要作用[16]。TLR4 為TLRs 家族成員中一種較為重要的模式識別受體，廣泛存于單核淋巴細胞表面，在先天性免疫系統以及獲得性免疫中，發揮重要作用[17]。TLR4 能夠誘導多種促炎因子水平的表達，進而在炎性損害過程發揮重要作用[18]。本研究結果發現，在慢阻肺急性加重期中TLR4mRNA 表達較高，同時與Th1、Th2 呈負相關（P＜0.05）。有學者研究顯示，TLR4 可與損傷相關分子模式結合，并可激活驗證通路，促進炎癥因子的分泌，活化巨噬細胞、中性粒細胞，導致呼吸道、肺血管發生炎癥反應，促進慢阻肺的發展，其研究與本研究保持一致，表明TLR4 與慢阻肺急性加重期進展過程密切相關，與免疫應答降低有關。

IL-4 與IFN-γ 均為多效細胞因子，在細胞中調節固有免疫及適應性免疫。其中IFN-γ 能夠激活巨噬細胞，誘導Th1 細胞分化，抑制Th2 細胞分化。IL-4 由Th2 細胞以及嗜堿性粒細胞產生，其能夠刺激B 細胞，并參與Th2 細胞的分化。Thl 與Th2 為T淋巴細胞中的兩個亞型，Th1、Th2 細胞亞群數量出現失衡為導致慢阻肺發病的重要機制[19]。Thl 能夠分泌出IFN-γ、IL-2 等多種因子，進而參與細胞的免疫，發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用，在呼吸疾病中，能夠增強微生物感染，包括病毒及細胞內病原體的免疫防御功能[20]。Th2 能夠分泌IL-4、IL-6等因子，介導B 細胞活化，促進腫瘤細胞增殖，在呼吸疾病中，參與呼吸感染進展、持續以及慢性化，同時對微生物感染發揮負性調控作用[21]。本研究結果顯示，在慢阻肺急性加重期中Thl 與Th2水平均較低，說明慢阻肺急性加重期中存在免疫應答降低。

綜上所述，在慢阻肺急性加重期中NOD2、TLR4 及Foxp3 均有參與，與患者出現感染具有密切聯系，同時NOD2、TLR4 及Foxp3 表達與Thl 與Th2水平呈負相關，免疫應答降低與NOD2、TLR4 及Foxp3 表達具有一定聯系。