高齡女性新鮮周期不同發育天數胚胎移植的臨床分析

王龍梅，邱乒乒，紀紅，姜雨飛，李萍

廈門大學附屬婦女兒童醫院生殖醫學科（廈門市生殖與遺傳重點實驗室），福建廈門 361003

隨著社會的發展，越來越多的女性推遲生育。研究表明女性生育力在32 歲時下降，在37 歲后下降的速度增加[1]。在先進且日趨成熟的輔助生殖技術幫助下，高齡不孕患者有能力實現懷孕。然而，高齡是女性不孕癥和產科并發癥的危險因素[2-3]，患者在進行不孕癥治療前應充分了解和評估潛在的并發癥。女性年齡的增長伴隨著卵母細胞數量的減少及染色體異常的風險增加[4-6]。大量研究表明，囊胚經過了體外初步淘汰過程，移植后妊娠率較卵裂期胚胎顯著提高。不過囊胚在培養箱內培養的時間較長，而較短時間的體外培養有利于降低外界環境對胚胎的影響，此外高齡女性獲卵數減少，一味追求囊胚移植可能會出現無可用胚胎周期取消的風險。因此，為了提高移植率和臨床妊娠率，對于高齡患者，需要權衡利弊后選擇合適的移植時機。本文回顧性分析2017 年1 月—2021 年1月在廈門大學附屬婦女兒童醫院行新鮮胚胎移植，年齡≥35 歲的832 例患者資料，通過分析實驗室指標及臨床結局，為高齡女性新鮮周期移植提供指導。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析本院行新鮮胚胎移植患者832 例的臨床資料，按移植胚胎的發育天數分為D2 移植組（113 例），D3 移植組（685 例），D5 囊胚移植組（34例）。所需數據來源于廈門大學附屬婦女兒童醫院生殖醫學科電子病歷系統。

1.2 納入與排除標準

納入標準：女性年齡≥35 歲；行新鮮胚胎移植的體外受精（in vitro fertilization, IVF）助孕患者。排除標準：囊胚移植前行囊胚活檢者；接受供卵。

1.3 方法

1.3.1 促排卵及取卵 綜合評估患者不孕原因及卵巢儲備情況，制訂合適的促排卵用藥方案。根據陰道B 超監測卵泡發育情況及抽血查血清雌二醇（estradiol, E2）、黃體生成素（luteinizing hormone, LH）上升情況，個性化調整促性腺激素劑量和種類。當目標卵泡的直徑達到18～20 mm 時注射重組人絨毛膜促性腺激素（艾澤，注冊證號S20130091），36 h 后陰道超聲取卵，獲得的卵冠丘復合物（oocyte corona cumulus complex, OCCs）用配子緩沖液洗滌后置于受精培養液中，37.0℃，6%CO2培養。

1.3.2 體外培養及胚胎評估 男方精液液化后，根據精子濃度及活力選擇密度梯度離心法或直接離心法優選處理，置于36.0℃，6%CO2培養箱。根據精液質量或既往體外受精（in vitro fertilization, IVF）助孕史選擇合適的方式進行授精。

授精后16～18 h 進行原核觀察，胞漿中有2 個原核為正常受精。授精后（44±1）h 和（68±1）h 進行D2及D3 胚胎觀察，根據卵裂球數目、均勻程度，碎片、細胞核情況及其他異常情況（如胞質粗糙、空泡等）進行胚胎質量評估。D3 發育至7～9 個細胞，卵裂球大小較均勻，細胞質均一、無大空泡，無多核現象，碎片低于20%，為優質胚胎。D3 發育至6～12 個細胞，無多核現象，碎片低于30%，為可用胚胎。胚胎評估為1～3 級者均為可用胚胎，1～2 級為優質胚胎。D5 胚胎觀察在受精后（116±2）h 進行，根據囊胚擴張程度、內細胞團（inner cell mass, ICM）及外滋養層（trophectoderm, TE）細胞數目及形態學進行評估。按照囊胚腔擴張程度分成1～6 期，根據ICM 和TE 細胞數分為A、B、C共3 個等級。3 期及以上囊胚，ICM 評級B 級以上(AA/BA/AB/BB/BC)為可用囊胚，其中ICM 及TE 評級為AA/BA/AB/BB 為優質囊胚。胚胎培養室的環境維持在室溫24～26℃，濕度40～60%。胚胎培養液均用礦物油覆蓋，放置于37℃，5%O2和6%CO2培養箱進行培養。

1.3.3 胚胎移植 新鮮胚胎移植一般在取卵后第3 日（D3）進行，如果行囊胚培養，則在第5 日（D5）移植。第2 天可用胚≤2 枚可選擇在第2 日（D2）進行胚胎移植。腹部B 超引導下進行胚胎移植，術后即給予陰道用黃體酮陰道緩釋凝膠（雪諾同，注冊證號H20140552）1 支進行黃體支持。

1.3.4 臨床隨訪判斷 胚胎移植后第13、15 天化驗血清中β 絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin, β-hCG），若β-hCG≥10 mIU/mL，則為生化妊娠。隔日復查翻倍良好，于移植術后的第4～6周陰道超聲檢查有孕囊或見胎心搏動則為臨床妊娠。孕12 周內自然流產視為早期流產。分娩活胎者視為活產。

1.4 觀察指標

（1）比較3 組患者的基礎資料，包括：年齡、體質指數（body mass index, BMI）、不孕年限、基礎卵泡刺激素（basal fsh level, bFSH）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone, AMH）、竇卵泡數（antral follicle count, AFC）。

（2）比較3 組患者的促排卵及實驗室指標，包括：促性腺激素（gonadotropins, Gn）的使用天數、Gn劑量、獲卵數、2PN 受精率、可用胚數、優胚數、平均移植胚胎數。

（3）比較3 組患者的生化妊娠率、臨床妊娠率、多胎率、早期流產率及活產率，計算公式如下。

①生化妊娠率=生化妊娠周期數/移植周期數×100%；②臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；③多胎率=≥2 個孕囊的妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；④早期流產率=孕12 周內流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；⑤活產率=分娩活胎周期數/移植周期數×100%。

1.5 統計方法

采用IBM SPSS 25.0 統計學軟件進行數據處理，計量資料不符合正態分布者，采用中位數M（P25，P75）描述，使用K-W 檢驗進行比較；計數資料以頻數和百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以是否臨床妊娠作為因變量，單因素分析具有意義或結合臨床有意義的指標作為自變量，采用二元Logistic 回歸模型輸入法對影響臨床結局的因素進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組患者一般資料比較

D2 移植組的年齡、bFSH 在3 組中最高，AMH、AFC 在3 組中最低，差異有統計學意義（P＜0.05）。D5 移植組的年齡、bFSH 在3 組中最低，AMH、AFC在3 組 中 最 高，差 異 有 統 計 學 意 義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組患者一般資料比較[M（P25，P75）]

2.2 3 組患者促排卵及實驗室指標比較

D2 移植組的獲卵數、可用胚、優胚數在3 組中最低，差異有統計學意義（P＜0.05），D5 移植組的獲卵數、可用胚數、優胚數在3 組中最高，差異有統計學意義（P＜0.05）；D3 移植組與D5 移植組的Gn 天數比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；D3 移植組的平均移植胚胎數在3 組中最高，D5 移植組最低，差異有統計學意義（P＜0.05）；3 組間Gn 劑量、2PN 受精率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3 組促排卵及實驗室指標(±s)

表2 3 組促排卵及實驗室指標(±s)

注：與D2 移植組比較，※P＜0.05；與D3 移植組比較，#P＜0.05

組別D2 移植（n=113）D3 移植（n=685）D5 移植（n=34）F 值P 值Gn 天數（d）9.7±0.2 9.6±0.1（10.2±0.2）#6.684 0.035 Gn 劑量（IU）2 730.3±58.9 2 787.5±24.7 2 719.5±106.6 0.925 0.630獲卵數（個）（4.1±0.3）#（7.9±0.1）※（11.3±0.9）※#126.526＜0.001 2PN 受精率（%）69.9±0.03 75.7±0.01 75.6±0.03 2.725 0.256可用胚數（個）（2.0±0.1）# （4.6±0.1）※ （7.0±0.6）※#133.566＜0.001優胚數（個）（0.7±0.1）#（1.4±0.1）※ （2.9±0.4）※#37.890＜0.001平均移植胚胎數（枚）（1.6±0.04）# （1.8±0.02）※ （1.2±0.07）※#83.387＜0.001

2.3 3 組患者臨床結局比較

D2 移植組的臨床妊娠率及活產率在3 組中最低，差異有統計學意義（P＜0.05）；D5 移植組的臨床妊娠率及活產率在3 組中最高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3 組患者臨床結局比較（%）

2.4 胚胎移植臨床結局的Logistic 回歸分析

移植胚胎的D5 移植、年齡以及移植胚胎數是影響臨床妊娠的獨立影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響不同發育天數胚胎移植臨床結局的二元Logistic 回歸分析

3 討論

近幾十年來，婦女推遲生育已經成為一個世界性的問題。輔助生殖技術在高齡產婦中的應用日益增多。研究表明，隨著母體年齡的增長，與減數分裂相關的卵母細胞非整倍體的發生率顯著增加[7-9]。在輔助生殖技術中，IVF 周期活產率與母親年齡直接相關。美國疾病控制與預防中心最近的數據顯示，2017年所有新鮮的、非捐贈者體外受精周期，＜35 歲女性的活產率為51.6%，這一比例隨著女性年齡的增長而下降：35～37 歲為37.5%，38～40 歲時為23.5%，41～42歲時為11.8%，而≥43歲的女性不到3.4%[10]。

在體外受精與胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）技術中，多胚胎移植可增加活產的可能性。然而，多胎妊娠的風險也會增加，并伴有一系列嚴重的母嬰并發癥[11-12]。單個胚胎移植是減少多胎妊娠最直接的方法。近年來，囊胚培養和移植已廣泛應用于大多數生殖中心。胚胎培養基優化以及培養技術的成熟為從卵裂期胚胎移植到囊胚期移植地轉變提供了技術支撐。囊胚培養的基本原理是通過延長體外培養時間來進一步篩選更具發育潛力的胚胎，進一步排除具有遺傳缺陷和高頻率的非整倍體胚胎[13-14]。同時，囊胚與子宮內膜同步性更好，可減少異位妊娠[15-17]，使單個囊胚移植成為了在保持臨床妊娠率的同時減少多胎妊娠的一種潛在有效方法。

本研究提示，與D2 和D3 移植相比，D5 囊胚移植是移植的首選。Sainte-Rose R 等[18]的最新研究報告也表明，體外延長培養對高齡女性是有利的。然而，囊胚培養并不適合所有患者[19]。對于獲卵數少或可用胚數少的高齡患者，繼續培養至D3 或者囊胚將有可能導致無可用胚、周期取消的風險。當前的挑戰是如何前瞻性地選擇合適的患者進行囊胚培養計劃，以及對于每個患者來說，與卵裂期移植相比，這項技術是否會增加活產健康嬰兒的可能性[20]。

本中心對于新鮮周期D2 天可用胚≤2 枚的患者采取的是D2 移植1～2 枚可用胚。對于大多數高齡女性主要是選取1～2 枚D3 胚移植。若D3 天胚胎數較多，則主要采取的是延長培養，移植1 枚D5 囊胚。本研究中D2 移植的臨床妊娠率最低為30.09%，D5移植的臨床妊娠率最高58.82%，Demián G 等[19]關于27 項RCT 研究報告也表明，新鮮囊胚移植后臨床妊娠率顯著升高（OR=1.30；95%CI:1.14～1.47；day 2～3:37.2%；day 5～6:43.2%；I2=56%），同時該報告指出使用新鮮卵裂期胚胎移植具有29%的活產率，而使用新鮮囊胚移植活產率為32%～42%，本文中D2、D3 和D5 移植的活產率分別是18.58%、33.28%和44.12%，兩者的結果較為一致。Yang L 等[21]采用Time-lapse模型篩選單個D3 天胚胎移植與采用傳統形態選擇的單個D5 移植的持續妊娠率進行比較，結果顯示D3 天的持續妊娠率顯著低于D5 天，說明如果移植的胚胎數量一致，質量良好的囊胚與卵裂期胚胎相比，具有更高的臨床妊娠率和活產率。

綜上所述，胚胎的數量和質量是高齡女性選擇移植時機的重要考慮標準。對于高齡女性，延長培養至囊胚階段，進行D5 囊胚移植，可獲得較高的臨床妊娠率以及活產率。對于獲卵數少，或可用胚少的患者，為患者爭取移植機會，避免出現無可用胚胎周期取消的情況，選擇D2 移植亦可獲得一定的臨床妊娠率及活產率。