粳稻種質資源稻瘟病抗性及抗性基因分析

鄒拓 耿雷躍 張薇 杜琪 孟令啟 張啟星

（1 河北省農林科學院濱海農業研究所，河北 唐山 063299；2 唐山市水稻育種重點實驗室，河北 唐山 063000；*第一/通訊作者：549282738@qq.com）

稻瘟病是水稻的主要病害之一，由真菌病原體（Magnaporthe oryzae）引起。1919年在印度首次發現稻瘟病，造成當年水稻減產4%左右[1]。在隨后的稻瘟病發生過程中，僅僅在印度東部地區就造成水稻減產50%左右[2-3]。稻瘟病菌具有多樣性，以致一個抗病品種在生產上使用3~5年就喪失抗性[4-6]。有研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻減產量可以滿足6 000 萬人口的糧食需求，導致的直接經濟損失高達50 億美元[7-8]。因此，篩選并應用新的抗病種質資源，有助于培育廣譜、持久的抗稻瘟病新品種。

近年來，隨著分子生物學的發展，越來越多的稻瘟病抗性基因被定位，在已定位的約100個稻瘟病抗性基因中有28個被成功克隆[9-10]。本研究中，利用Pi37、Pib、Pi9、Pigm、Pid3、Piz、Pi36、Pi5、Pia、Pikh、Pik 和 Pita基因的特異性分子標記對參試粳稻資源進行抗病基因型鑒定。其中，Pib 來自品種BL1，對日本大多數稻瘟病菌小種有抗性，對中國的菌株ZB13 和ZC15 也表現抗病反應[11]；Pita 對稻瘟病菌菌株 ZN57 和 ZN61 表現抗病[12]；Pia 對江蘇省生理小種表現為強抗性[13]。

本研究中利用現有的粳稻資源，通過表型評價與基因型鑒定相結合的方式，分析基因型與其抗病反應的關系，找到有效的抗病基因或聚合基因型，篩選到對本地區稻瘟病小種具有較強抗性的種質資源，對今后抗稻瘟病水稻育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共用到157 份粳稻材料，具體信息如表1。2019年4月至10月種植于河北省農林科學院濱海農業研究所試驗基地。

表1 粳稻資源信息

1.2 實驗方法

1.2.1 抗病基因分子檢測

水稻分蘗高峰期取葉片樣品，存放至－20℃冰箱。水稻基因組DNA 的提取按上海植物生理研究所的TPS 抽提法稍加修改。Pi37、Pib、Pi9、Pigm、Pid3、Piz、Pi36、Pi5、Pia、Pikh、Pik 和 Pita 等 12個基因的引物序列及擴增產物信息如表2，引物由北京擎科生物公司代為合成。PCR 的反應體系總體積 20 μl，其中包括0.2 μl dNTP（10 mM），2.0 μl 10×PCR buffer（含 15 mM MgCl2），引物各 1.5 μl ，0.1 μl Taq 酶（5 U/μl），2 μl 材料基因組DNA，其余體積量由ddH2O 補齊。PCR 反應程序：94℃預變性 5 min；94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸45 s；72℃，延伸5 min（括號部分為35個循環）。待溫度降至25℃，移至4℃冰箱待用。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行擴增片段的分離，在凝膠成像系統下拍照讀帶。

表2 抗稻瘟病基因分子標記引物及擴增片段信息

1.2.2 田間誘發稻瘟病鑒定

供試的 157 份材料于 4月20日播種，5月30日移栽，行株距20 cm×10 cm，每間隔10 份材料種植1 份麗江新團黑谷并在鑒定圃周圍種植1 圈麗江新團黑谷。鑒定圃內防蟲不治病，增施氮肥，提高田間濕度，其余管理措施同大田。當感病品種麗江新團黑谷發病后確定稻瘟病誘發有效。7月26日至31日進行田間葉瘟發病調查，8月20日開始調查穗瘟。調查方法及病級計算參照NY/T 2646-2014[14]。

2 結果與分析

2.1 粳稻資源田間感病情況

據田間調查結果，在157 份材料中，表現為抗的2份、占比1.27%，中抗70 份、占比 44.59%，中感64 份、占比40.76%，感及高感共21 份、占比13.38%。可見，大多數種質材料抗病綜合指數分布在中抗及中感水平間，表現為抗、感及高感的材料較少。參試材料中，葉瘟平均病級4.00，變異系數40.00%；穗瘟平均病級4.23，變異系數50.59%。

2.2 12個抗病基因的檢測結果

為明確不同基因型對本地區稻瘟病抗性表現情況，選擇抗性表現最好的和抗性表現最差的材料各20份，進行抗稻瘟病基因分子檢測。通過比較表現極端的材料，找到材料中基因數量和基因型的差異與抗病性的關系。從圖1 可見，檢出頻率在15 次以上的有8個基因，其中Pid3 和Piz 基因檢出頻率最高，分別檢出40 次和34 次；檢出頻率在10 次以下的有4個基因，其中，Pi9 未檢出。

圖1 12個抗病基因的檢測情況

從表3 可見，40 份材料中，平均含有抗性基因5.2個；抗稻瘟病綜合指數表現為抗的材料中含有的抗病基因為5~8個，表現為感病的材料中，含有的抗病基因為2~5個。其中，ZY29 具有抗性基因最多，包含Pi5、Piz、Pik、Pikh、Pi37、Pid3、Pia、Pita 等 8個基因，抗病綜合指數為2.5，表現為中抗。ZY115 具有抗性基因數量最少，僅含Pi36、Pid3，抗病綜合指數為8.3，表現為高感。

2.3 材料抗性與基因型及基因數量的關系

通過對比抗病材料與感病材料的基因型看出（表3、圖2），抗病材料與感病材料相比，大多具有Pigm（5∶2）、Pia（18∶0）、Pita（5∶0）Pik（17∶4）、Pi5（12∶4）這 5個基因，括號中數字為具有此種基因抗病材料與感病材料的數量。由此可見，這5個基因在本地區對稻瘟病的抗病性起到一定作用。利用SPSS 對抗病基因數量與葉瘟病級進行相關性分析，結果（表4）表明，材料中的抗病基因數量與稻瘟病綜合指數的相關系數為-0.844，在P=0.01 水平上達到負顯著性相關。可見，含有更多抗性基因的水稻材料具有更好的稻瘟病抗性。

圖2 抗病材料與感病材料在基因型上的差異

表3 40 份材料的基因型及抗稻瘟病綜合指數

表4 抗病綜合指數與抗病基因個數的相關性分析

2.4 種植資源在抗病育種上的應用

從表 5 可見，ZY2、ZY13、ZY15 和 ZY21 等 4個種質資源抗病性好，在株高、穗頸長、產量等性狀上能夠達到作為育種親本的要求。因此，育種者可利用這些材料通過分子標記輔助選擇與常規育種手段相結合的方式，快速、準確的選育聚合多個抗稻瘟病基因的新品種。

表5 抗病材料的農藝及產量性狀

3 討論

前人研究中，少有利用粳稻資源在冀東地區做稻瘟病抗性評價，而不同稻區稻瘟病生理小種自身也有高度的變異性，氣候條件也是影響稻瘟病發病的主要因素[22]。另外，病圃田間的誘發致病的生理小種是未知的混合小種, 而且不同位置的侵染菌種也可能不盡相同，加上小氣候差異等因素，所以田間誘發鑒定比人工接種鑒定的可靠性差些[23]。因此，本課題組利用157 份粳稻資源在河北省農林科學院濱海農業研究所試驗基地進行田間感病試驗，重點結合本地區生態環境及稻瘟病生理小種評價材料的抗病性，再結合分子標記對抗病基因鑒定，挖掘在冀東地區表現高抗性抗病基因，為冀東地區抗病育種提供有效的基因供體。

本次用到的12個抗稻瘟病基因分布在第1、第2、第 6、第 8、第 9、第 11 和第 12 染色體上，全部已經克隆，效應及位點比較明確[9-10]。試驗中，用到的標記大多為功能標記。目前定位到的抗性基因除以上7 條染色體外，還存在于第4、第5、第7 和第10 染色體上，但其定位基因較少，未有基因簇的出現[24]。因此，本次選擇的基因具有一定的代表性和準確性。

本研究中，通過對病級和抗病基因數量進行相關性分析，得到病級與基因數量成負向極顯著，因此聚合更多的抗性基因會提高品種的抗病性，這與張羽提出的稻瘟病抗性也屬于數量性狀，隨著抗性基因數目的增多，品種的抗病性呈上升趨勢一致[25]。

4 結論

對157份粳稻資源進行稻瘟病抗性自然誘發鑒定，對稻瘟病表現為抗的有2 份、表現為中抗的有70份。結合稻瘟病基因檢測，對比抗病材料與感病材料基因型得到 Pigm、Pia、Pita、Pik、Pi5 等 5個對冀東地區稻瘟病有明顯抗病作用的抗性基因，且聚合的抗病基因越多，材料的抗病能力越高。進一步結合農藝及產量性狀得到 ZY2、ZY13、ZY15 和 ZY21 這 4個種質資源可作為抗稻瘟病育種中的抗病親本。