高效液相色譜-原子熒光光譜聯用法對嬰幼兒奶粉和輔食中不同形態(tài)汞的測定

楊娟，平文卉，葉青華，張穎茜，王金鑫，戴志英

分析檢測

高效液相色譜-原子熒光光譜聯用法對嬰幼兒奶粉和輔食中不同形態(tài)汞的測定

楊娟，平文卉，葉青華，張穎茜，王金鑫，戴志英

（南通市疾病預防控制中心， 江蘇 南通 226007）

采用高效液相色譜-原子熒光聯用儀測定嬰幼兒奶粉和輔食中不同形態(tài)汞含量。樣品用冰浴超聲振蕩提取后用離心機將樣液離心分離，分離好的上清液用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值，過膜后經過形態(tài)分析儀預處理，由高效液相色譜分離，最后用原子熒光光度計檢測。甲基汞、乙基汞和二價汞3 種形態(tài)汞標準曲線的線性范圍0～10 μg·L-1；相關系數均大于0.99；檢出限分別為 0.51、0.50、0.52 μg·L-1；平均加標回收率為 90.8%～109.3%；RSD為1.76%～7.07%。該法測定嬰幼兒奶粉和輔食形態(tài)汞含量，方法的精密度和準確度及線性關系均比較滿意，適合用于嬰幼兒奶粉和輔食形態(tài)汞含量的測定。

高效液相色譜-原子熒光聯用法； 嬰幼兒奶粉和輔食； 形態(tài)汞

近幾年，隨著生活水平的提高，食品安全問題受到人民群眾的關注，二胎政策放開之后，奶粉、輔食量需求量增高，其安全問題成為父母首要關注的問題[1]。

汞具有易揮發(fā)、易富集的特點[2]。毒性有機汞高于無機汞，有機汞中甲基汞毒性最大。甲基汞很容易穿過血腦屏障并損害人的神經系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)。有機汞是一種親脂性有機化合物，很容易在食物鏈中富集。被人體吸收后，大多數無機汞會在腎臟中積累，對腎臟造成不可逆轉的損害，甲基汞更可能是人體致癌物。

由于汞對人類健康造成的巨大損害，汞污染在世界范圍內變得越來越重要。由于汞不可降解性和強大的生物蓄積性，土壤和水中的汞經過生物蓄積后會進入食品原料，從而危害人體健康。水和土壤中的汞通過微生物甲基化并通過食物鏈逐漸富集在魚類等水產動物中，因此，魚類等水產動物食品中甲基汞的含量普遍高于其周邊環(huán)境。由于濫用農藥，化工廠等排污不當，所以植物食物容易被汞污染，在微生物的作用下，無機汞轉化為甲基汞[3]。此外，食物在采集、運輸、加工和包裝過程中，溶解在金屬容器中的汞和含汞的食品添加劑也可能會污染食品，尤其是奶制品，現在女性工作壓力大，事業(yè)和家庭兼顧，晚婚晚育的現象普遍存在，生育后很多要么奶水不足，要么背奶，要么干脆選擇配方乳，因為對于嬰幼兒來說配方乳的需求量巨大，然而國內出現過三鹿毒奶粉事件后，媽媽對選擇奶粉方便更加謹慎，奶粉的安全性，奶源的安全性都很重視，因為加強配方奶粉和輔食質量的監(jiān)測監(jiān)管非常有必要。

對于水樣，特別是飲用水，預處理萃取快速而簡單[4-7]，對于食品樣品，尤其是奶粉和輔食樣品中含有脂肪，蛋白質和其他復雜結構的物質。在預處理過程中將使用大量的酸和萃取劑，萃取過程環(huán)節(jié)復雜，影響提取效率，進而影響檢測結果，并且污染環(huán)境[8-13]，因而前處理過程至關重要。

目前不同形態(tài)汞的測定方法主要是液相色譜-原子熒光光譜聯用法（HPLC-AFS）和液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法（HPLC-ICP-MS）[14]。兩種方法相比, HPLC-AFS儀器結構簡單、儀器耗材成本低、靈敏度高、選擇性好和普及廣等優(yōu)點，因而使用該方法檢測有機汞的頻率相對高，國內外報道的機會比較多，方法也相對成熟。

在這項工作中，使用5 mol·L-1HCl溶液超聲提取樣品中的汞。使用6 mol·L-1NaOH溶液將樣品的pH調節(jié)至2～7。C18反相色譜柱分離，在流動相中添加L-半胱氨酸作為汞配合物，在紫外線照射下甲基汞轉化為無機汞，在酸性條件下，無機汞與硼氫化鉀在線反應生成汞蒸氣，通過原子熒光光譜法[15]用于檢測不同形式的汞。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SAP-10液相色譜-原子熒光光譜聯用儀，艾杰爾反相C18分析柱，汞空心陰極燈，KQ-300TDB型高頻數控超聲波清洗器，BI0FUGE PRlM0 R230冷凍離心機，JY10002電子天平。

1 000 mg·L-1汞標準溶液(北京有色金屬研究院)；

甲基汞標準溶液(65.2±2.5 μg·g-1，中國計量科學研究院，GBW08675)；

乙基汞標準溶液(70.6±2.5 μg·g-1，中國計量科學研究院，GBW（E）081524)；

湖底沉積物中甲基汞及無機元素標準物質（甲基汞5.2±0.7 ng·g-1, 總汞0.48±0.03 μg·g-1中國計量科學研究院，GBW08308）；

甲醇(色譜純)；L-半胱氨酸(生化試劑)，國藥集團；硼氫化鉀：SIGMA;鹽酸(優(yōu)級純)；乙酸銨、氫氧化鈉：分析純，國藥集團；

液相流動相：5%甲醇、0.1% L-半胱氨酸、0.06 mol·L-1乙酸銨，稱取1.21 g L-半胱氨酸，4.62 g乙酸銨，放入1 L的容量瓶中，加入超純水超聲溶解，再加入50 mL色譜純甲醇，用超純水定容至1 L，用溶劑過濾器過水相膜抽濾，水浴超聲30 min，流動相需現用現配。

形態(tài)分析試劑：7%鹽酸溶液作為載流，20 g·L-1硼氫化鉀溶液作為還原劑，準確稱取20.0 g硼氫化鉀，用3.5 g·L-1氫氧化鉀溶液溶解并稀釋至1 L，現用現配。

1.2 儀器工作條件

液相色譜：C18色譜分析柱(150 mm×4.6 mm×5 um)，C18預柱(10 mm×4.6 mm×5 um)，泵流速1.0 mL·min-1，進樣體積0.1 mL 。

原子熒光：負高壓280 V，汞燈電流40 mA，載氣流速400 mL·min-1，屏蔽氣流速600 mL·min-1。

形態(tài)分析預處理裝置條件：泵速：60 r·min-1，紫外燈（UV）開。

1.3 試驗方法

稱取奶粉和輔食樣品約0.50～2.0 g，置于15 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 5 mol·L-1現配鹽酸溶液，搖勻放置冰箱冷藏過夜?？照{制冷溫度下冰浴超聲提取60 min，期間振搖數次。4 ℃下以8 000 r· min-1轉速離心15 min。準確吸取2.0 mL上清液至5 mL容量瓶或者刻度試管中（刻度試管置于冰水混合物中），逐滴加入6 mol·L-1氫氧化鈉溶液，邊滴邊迅速搖勻，使樣液pH值在2～7之間。加入0.1 mL 10 g·L-1的L-半胱氨酸溶液，最后用水定容至刻度。最后經0.45μm水相濾膜過濾，待測。同時做空白試驗。將處理好的試樣溶液100 μL注入液相色譜-原子熒光光譜聯用儀中，檢測得到3種汞形態(tài)色譜圖，用外標峰面積法定量計算出樣品中3種形態(tài)汞含量。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

元素形態(tài)分析需要對樣品進行復雜的前處理,包括化學提取和富集。汞不同形態(tài)的提取方法主要包括堿消解法和酸提取法；由于甲基汞是一種脂溶性化合物, 通常與蛋白質和其他物質結合。通過查文獻得知陳德泉等人的工作證明在眾多酸堿提取劑中鹽酸的提取率是最高的，并且不會出現乳化現象，因此本實驗在超聲輔助作用下用鹽酸萃取的,通過加標回收實驗證明, 提取過程中汞沒有發(fā)生形態(tài)之間的轉化因此選擇鹽酸作為萃取劑來提取。常用的絡合劑主要有L-半胱氨酸和硫脲，本實驗選擇L-半胱氨酸。

2.2 試驗條件優(yōu)化

含有汞的樣品在超聲提取時，隨著超聲產熱，水溫逐漸升高，汞化合物極易揮發(fā)，所以，在水中可加入冰塊來控制水溫上升或者采用可以制冷的超聲儀進行超聲提取。在用氫氧化鈉溶液調樣品pH值時，因樣品預處理加入的鹽酸和調pH值用的氫氧化鈉發(fā)生中和反應會迅速升溫，導致汞化合物揮發(fā)檢測結果偏低。因此樣品在調pH值時需在冰浴下進行，邊加氫氧化鈉邊震蕩混勻讓產生的熱釋放到冰水混合物中。加標回收試驗證明，溫度對實驗結果影響比較大，控制前處理溫度至關重要。

2.3 標準曲線和檢出限

由于有機汞是劇毒品，本實驗標準系列范圍確定低濃度0～10 μg·L-1，實驗證明，滿足檢測要求。分別吸取1 μg·mL-1的甲基汞、乙基汞和汞混標溶液0, 20, 40, 60, 80, 100 μL于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度分別為0、2、4、6、8、10 μg·L-1的標準系列，吸取100μL標準系列溶液進行測定，分別以色譜峰面積為縱坐標，以甲基汞、乙基汞和二價汞的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，以10倍信噪比計算檢出下限。線性回歸方程、相關系數和檢出下限見表1。

表1 方法的線性關系、相關系數和檢出下限

2.4 加標回收實驗和精密度

分別向奶粉樣品中加入質量濃度為2.0、6.0、10.0 μg·L-13種不同形態(tài)的汞標化合物進行加標回收實驗，平行測定6次，得到加標回收率和相對標準偏差結果見表2。甲基汞的加標回收率為94.7%～103.5%，乙基汞為95.6%～107.0%，二價汞為90.8%～109.3%，表明該方法測定準確度較高。甲基汞的相對標準偏差（RSD）為1.76%～3.63%，乙基汞為1.94%～2.52%，二價汞為3.79%～7.07%，表明甲基汞和乙基汞穩(wěn)定性比較好，二價汞穩(wěn)定性欠缺，可能和二價汞易揮發(fā)的性質相關。

表2 奶粉樣品加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.5 方法準確度實驗

采用 HPLC-AFS 法對質控樣品GBW08308湖底沉積物中不同形態(tài)汞的含量進行測定, 檢測得甲基汞的質量分數為5.02 μg·kg-1（湖底沉積物質控樣品證書中甲基汞質量分數為5.2±0.7μg·kg-1），測得值與證書中中位值基本吻合，從而驗證了本方法具有較高的準確性。

2.6 實際樣品檢測實驗

采用 HPLC-AFS 法對20份奶粉、10份輔食樣品中不同形態(tài)汞的含量進行測定, 其中輔食樣品中有1份深海鱈魚腸檢出甲基汞的質量分數為3.65 μg·kg-1, 乙基汞質量分數為 0.86 μg·kg-1, 二價汞質量分數為 2.59 μg·kg-1，用全自動測汞儀測定總汞質量分數為38.0 μg·kg-1。不同形態(tài)汞混合標準溶液(3種形態(tài)汞質量濃度均為6.0 μg·L-1)的測定圖譜如圖1 所示, 深海鱈魚腸樣品的測定圖譜如圖2 所示。

3 結 論

實驗運用 HPLC-AFS 法對嬰幼兒奶粉以及輔食中不同形態(tài)的汞含量進行測定, 建立了嬰幼兒奶粉以及輔食中不同形態(tài)汞的提取、分離方法, 通過對質控標準樣GBW08308湖底沉積物中的不同形態(tài)汞進行檢測, 其中甲基汞檢測結果和證書中甲基汞的值很接近，該方法操作簡便快捷、準確度很高、重復性很好, 適合用于對嬰幼兒奶粉以及輔食中不同形態(tài)汞以及總汞含量的檢測。實際樣品檢測得出，奶粉樣品未檢出總汞和有機汞，說明嬰幼兒奶粉質量有一定的保障，不管是國產的還是進口的均未出現超標樣品。

圖1 HPLC-AFS法測定混和標準溶液色譜圖

圖2 HPLC-AFS法測定深海鱈魚腸色譜圖

雖然檢出率不高，奶粉未檢出，但是嬰幼兒乳制品重金屬污染物限量指標的國家標準缺失，對于乳制品生產企業(yè)監(jiān)管難度會加大，乳制品生產企業(yè)的質量完全靠自律，嬰幼兒奶粉質量安全方面的問題存在一定的隱患。呼吁制定嚴格詳細的標準才能應對防不勝防的乳品安全質量問題。

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Determination of Different Forms of Mercury in Infant Milk Powder and Complementary Food by High Performance Liquid Chromatography-Atomic Fluorescence Spectrometry

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（Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong Jiangsu 226007, China）

High-performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry was used to determine the different forms of mercury in infant formula and complementary foods.The sample was extracted by ultrasonic shaking with an ice bath, and then centrifuged to separate the sample solution. The separated supernatant was adjusted to pH with sodium hydroxide solution, passed through a membrane and pretreated by a spectrometer, and separated by high performance liquid chromatography. At last, it was detected with the atomic fluorescence spectrometer. The linear range of the three standard mercury profiles of methylmercury,ethylmercury and divalent mercury was 0～10 μg·L-1;The correlation coefficient was greater than 0.99;The detection limits were 0.51,0.50,0.52 μg·L-1,respectively;The average spike recovery was 90.8%～109.3%;The RSD was 1.76%～7.07%. The precision,accuracy and linearity of the method are satisfactory. It is suitable for the determination of mercury content in infant formula and food supplement.

High performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry; Infant formula and complementary food; Morphology mercury

南通市科技局（項目編號：YYZ17092；MS12017018-6）。

2021-11-26

楊娟（1985-），女，河南省項城市人，工程師，碩士，2013年畢業(yè)于揚州大學學校分析化學專業(yè)，研究方向：理化檢驗技術。

戴志英（1967-），女，高級工程師，研究方向：理化檢驗技術。

TQ462.24

A

1004-0935（2022）03-0434-04