麻黃連軺赤小豆湯對特應性皮炎模型小鼠皮膚屏障功能的影響*

袁慧敏，孫燕，李彩艷，劉雙巧，張玉鑫，劉錦鋼，湯陽，張淑靜，馮婧，鄭豐杰

北京中醫藥大學，北京 100029

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性復發性、瘙癢性、炎癥性皮膚疾病，以炎性滲出、濕疹樣皮損、苔蘚化和皮膚干燥為主要臨床表現，其患病率呈逐步上升趨勢，特別是兒童患病率超過20%，嚴重影響患者生活質量［1］。AD病因及發病機制尚未闡明，目前認為其與遺傳、環境、皮膚屏障損傷和神經免疫失調等因素密切相關［2］，而皮膚屏障和免疫炎癥失衡之間的內外竄擾是AD發生發展的重要病理機制，已成為業內共識，皮膚屏障損傷及修復已成為AD防治領域的重要研究課題之一［3］。

AD屬于中醫學“乳癬”“奶癬”“四彎風”等病證范疇，其病因病機主要是先天稟賦不足、胎毒遺熱或后天調攝不當、脾失健運，復感風、濕、熱邪，蘊郁肌膚，具有表里同病、虛實夾雜的病證特點［4］。麻黃連軺赤小豆湯出自《傷寒論》，外可發散風濕熱邪，內能健脾和中、清熱利濕，是公認的表里雙解、標本同治之劑，臨床用其加減辨治AD療效頗佳［5-6］，但其對AD皮膚屏障功能的影響尚需要進一步的研究。

1 材料

1.1 動物SPF級6周齡雄性BALB／c小鼠120只，體質量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2016-0006。飼養于北京中醫藥大學動物房IVC通氣籠，環境溫度（25±2）℃，濕度40%～60%，每天自由飲水進食。本研究實驗動物的使用和處置方法符合動物福利的要求，實驗經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（動物倫理編號：BUCM-4-2019091101-3047）。

1.2 藥物與試劑麻黃、連翹、苦杏仁、赤小豆、大棗、桑白皮、炙甘草、生姜（北京同仁堂藥店）；糠酸莫米松凝膠［規格：0.1%，華潤三九（南昌）藥業有限公司，批號：2006007J］；2，4-二硝基氟苯（2，4-diitrofluorobenzene，DNFB，美國Sigma公司，批號：M24318031）；丙酮、無水乙醇（分析純，北京化工廠，批號：20170209、20200617）；橄欖油（西班牙Mueloliva公司，批號：20190515）；二甲苯（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司，批號：20190325）；蘇木素染色液、伊紅染色液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20042002、20060901）；分化液、返藍染色液（北京益利精細化學品有限公司，批號：20200730、20200528）。

1.3 儀器H6型獨立通風籠（蘇杭科技器材有限公司）；MPA4型皮膚多探頭測試儀（德國Courage+Khazakz公司）；HistoCore PEARL型全自動封閉式組織脫水機、HistoCore Arcadia H型石蠟包埋機、HistoCore Arcadia C型組織切片冷臺、M2255型全自動切片機、HI1210型攤片機、HI1220型烤片機（德國Leica公司）；Revolve FL型正倒置一體熒光顯微鏡（美國Echo公司）。

2 方法

2.1 藥物制備《傷寒論》記載麻黃連軺赤小豆湯由麻黃（二兩）、連軺（二兩）、杏仁（四十個）、赤小豆（一升）、大棗（十二枚）、生梓白皮（一升）、生姜（二兩）、炙甘草（二兩）組成，本課題組前期經考證實測，得出其現今臨床參考劑量［7］：麻黃6 g，連翹6 g，苦杏仁3 g，赤小豆34 g，大棗7 g，桑白皮11 g，生姜6 g，炙甘草6 g。按上述劑量稱取各藥材，共79 g，為1次灌胃所需的生藥量，加10倍量的水（即790 g），將藥材完全沒于水中浸泡1 h后，煎煮1.5 h，將藥液倒出。再加入8倍量的水，煎煮1.5 h。將兩次藥液混合后，水浴濃縮，濃縮至1 g生藥·mL-1，4℃冰箱儲存備用。每次取當日灌胃劑量，于灌胃前30 min預熱至適宜溫度。

2.2 分組、造模與給藥采用隨機數字表法將120只雄性BALB／c小鼠分為正常組（n＝24）、模型組（n＝32）、糠酸莫米松組（n＝32）和麻黃連軺赤小豆湯組（n＝32）。除正常組外，其余組小鼠采用DNFB反復刺激皮膚的方法制備AD小鼠模型［8］。具體方法如下（見圖1）：致敏前用電推剪和脫毛膏除去小鼠背部毛發，面積約2.0 cm×3.0 cm。在1.0 cm×1.0 cm的紗布上滴加1%的DNFB溶液200μL，并均勻涂抹在小鼠背部皮膚，每周2次（即第1、4、8、11天）。第15天開始改用0.2%的DNFB溶液涂抹小鼠背部皮膚，每周2次，持續3周（即第15、18、21、25、28、32、35天）。正常組小鼠于相應時間點在背部涂抹等量基質溶液（丙酮∶橄欖油＝4∶1）。分別在實驗第4、18、32、39天進行藥物干預，麻黃連軺赤小豆湯組用麻黃連軺赤小豆湯灌胃（11.98 g·kg-1·d-1），每日2次；糠酸莫米松組于小鼠皮損處均勻涂抹適量0.1%糠酸莫米松凝膠，每日2次；正常組和模型組給予等量常溫蒸餾水灌胃，每日2次，連續7天。

圖1 AD模型小鼠制備流程

2.3 動物處死與取材各時間點分別給藥一周后，對實驗動物進行取材，即分別于實驗第11、25、39、46天，分四批次（每批次動物n＝30）對各組小鼠進行2%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，摘眼球取血處死，無菌條件下取小鼠皮損處皮膚組織，以4%多聚甲醛溶液固定保存；其他皮膚皮損組織-80℃保存，用于指標檢測。

2.4 皮損評分參照文獻［9］進行皮損評分評估。每次皮膚致敏前肉眼觀察皮膚變化并拍照記錄，從出血／紅斑、疤痕／干燥、水腫、表皮脫落／侵蝕／苔蘚樣變四方面進行等級評分。

2.5 經皮水分散失（trans epidermal water loss，TEW L）檢測于每次皮膚致敏前和處死前，平展小鼠背部剃毛區域，使用Tewameter TM300探頭輕觸小鼠皮膚，應用皮膚測定儀測定皮損及非皮損處經皮散水量，使用標準測量法，設置每次測定時間為20 s，重復檢測3次，讀取平均值。保持每次檢測時間、室內環境、檢測人員及其他條件相對一致。

2.6 皮膚pH值檢測于每次皮膚致敏前和處死前，使用pH 905探頭測定皮損及非皮損處pH值，每次重復檢測3次，結果取平均值。保持每次檢測時間、室內環境、檢測人員及其他條件相對一致。

2.7 皮膚組織病理學取小鼠剃毛區域皮膚組織，以4%多聚甲醛溶液固定過夜，將組織標本脫水、石蠟包埋、切片（厚度6μm）、脫蠟、蘇木精-伊紅（htoxylin eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理改變。

2.8 皮損評分、TEW L、pH的相關性分析考察選擇模型組四個時間點皮損評分、pH值與TEWL值的相關數據進行斯皮爾曼（Spearman）相關性分析，評估三者對AD模型的影響。

2.9 統計學方法采用GraphPad Prism 9統計學軟件進行數據處理分析，各組數據以平均值±標準差（±s）表示。多組計量資料采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 麻黃連軺赤小豆湯對AD模型小鼠皮膚狀態的影響AD模型組小鼠復制過程中不同時間點，其皮損呈現出與臨床相近的不同病理進程［2，10-11］，即急性期（第1—11天）依次為紅斑、出血點→皮膚水腫潰爛→新生血痂→血痂變硬；急性進展期（第12—25天）表現為血痂脫落與新生瘢痕并存；亞急性期（第26—39天）皮膚散在紅斑出血點、瘢痕增生、鱗屑或苔蘚樣干燥等；慢性期（第39天以后）主要以皮膚干燥為主。糠酸莫米松和麻黃連軺赤小豆湯均可有效改善AD小鼠皮損，且麻黃連軺赤小豆湯作用效果優于糠酸莫米松，可顯著減少AD模型小鼠皮膚亞急性期出血點，改善皮膚干燥鱗屑或苔蘚樣現象。見圖2。

圖2 不同時間點各組小鼠背部皮損觀察

3.2 麻黃連軺赤小豆湯對AD模型小鼠皮損評分的影響與正常組相比，模型組小鼠各時間點皮損評分均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，糠酸莫米松組小鼠皮損評分在急性期、急性進展期有下降趨勢；麻黃連軺赤小豆湯組在各時期均有下降趨勢，但無統計學差異。見表1。

表1 不同時間點各組小鼠背部皮損評分比較 （±s，n＝6）

表1 不同時間點各組小鼠背部皮損評分比較 （±s，n＝6）

注：與正常組比較，**P＜0.01

組別 皮損評分（分）第11天 第25天 第39天 第46天0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 4.67±0.52** 1.67±0.52** 1.50±0.55** 1.33±0.52**糠酸莫米松組 4.33±0.52 1.50±0.55 1.67±0.52 1.33±0.52麻黃連軺赤小豆湯組正常組3.83±0.41 1.33±0.52 1.33±0.52 1.17±0.41

3.3 麻黃連軺赤小豆湯對AD模型小鼠皮膚組織病理學改變的影響正常組小鼠皮膚組織結構規則，細胞形態正常，上皮層次完整清楚。AD模型組小鼠4個觀察點皮膚組織表現依次為：表皮增厚，以棘細胞層增厚為主→表皮增厚，棘細胞層增生變厚→表皮增厚，棘細胞層顯著增厚→表皮增厚減輕，棘細胞層增生減輕等。與模型組相比，糠酸莫米松和麻黃連軺赤小豆湯可不同程度的改善模型小鼠皮膚病理改變，如減少上皮增生等。見圖3。

圖3 不同時間點各組小鼠皮膚組織病理學觀察（HE染色，×10）

3.4 麻黃連軺赤小豆湯對AD模型小鼠皮膚TEWL的影響與正常組相比，模型組小鼠皮損區各時間點TEWL值均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，麻黃連軺赤小豆湯組與糠酸莫米松組小鼠第11天皮膚TEWL明顯升高（P＜0.01），第25、39、46天3個時間點皮膚TEWL均降低，且麻黃連軺赤小豆湯組小鼠第39、46天兩個時間點TEWL值顯著下降（P＜0.01）。見表2。

表2 不同時間點各組小鼠背部皮損區皮膚TEWL比較 （±s，n＝6）

表2 不同時間點各組小鼠背部皮損區皮膚TEWL比較 （±s，n＝6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01

組別 皮膚TEWL（g·h-1·m-2）第11天 第25天 第39天 第46天12.93±2.61 12.60±2.11 16.85±3.07 8.70±2.37模型組 72.73±6.24** 54.97±4.65** 50.80±9.02** 14.40±1.43**糠酸莫米松組 88.20±3.01＃＃ 45.18±9.12 45.52±4.81 11.92±1.13麻黃連軺赤小豆湯組 89.03±6.55＃＃ 41.63±12.80 33.50±2.44＃＃ 9.70±1.22正常組＃＃

3.5 麻黃連軺赤小豆湯對AD模型小鼠皮膚pH的影響與正常組相比，模型組小鼠皮損區第11、25、39天3個觀測點pH值均明顯升高（P＜0.01），第46天有升高趨勢。與模型組相比，糠酸莫米松組小鼠第11天皮膚pH值顯著降低（P＜0.01）；麻黃連軺赤小豆湯組小鼠第11、25、39天3個觀測點皮膚pH值均明顯降低（P＜0.05），第46天有降低趨勢，但無統計學差異。見表3。

表3 不同時間點各組小鼠背部皮膚pH比較 （±s，n＝6）

表3 不同時間點各組小鼠背部皮膚pH比較 （±s，n＝6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 皮膚pH第11天 第25天 第39天 第46天5.59±0.20 6.31±0.35 6.74±0.28 6.42±0.40模型組 6.33±0.21** 7.07±0.19** 7.20±0.22** 6.54±0.13糠酸莫米松組 5.64±0.08＃＃ 6.81±0.49 7.08±0.17 6.51±0.18麻黃連軺赤小豆湯組 5.86±0.31＃ 6.43±0.21＃＃ 6.84±0.09＃正常組6.41±0.26

3.6 皮損評分、TEWL、pH的相關分析AD模型小鼠皮損評分與pH值呈線性正相關關系（Spearman R2＝0.211 7，P＝0.014 7）；皮損評分與TEWL值呈線性正相關關系（Spearman R2＝0.610 4，P＜0.000 1）；pH值與TEWL值呈線性正相關關系（Spearman R2＝0.351 2，P＝0.002 3）；提示經皮水分丟失增加，皮膚表面pH升高，可共同加重皮膚屏障功能障礙。見圖4。

圖4 皮損評分、TWEL、pH的相關分析

4 討論

AD與遺傳、過敏等因素有關，但其確切病因及發病機制尚未完全闡明，目前占主導地位的是學者Peter M.Elias提出的“內外串擾病機學說”［12-13］。“內外串擾病機學說”中，“內”主要指機體免疫功能失常及其引發的全身性過敏性炎癥，“外”主要指遺傳或后天環境因素造成的皮膚屏障功能受損，而關于皮膚屏障功能在AD發病中作用的揭示是過去10年里AD研究領域最重要的發現。皮膚屏障檢測可客觀反映皮膚功能，常用于皮膚病患者的診療［14］。HE組織學、皮膚B超、皮膚共聚焦顯微鏡等常用于皮膚細胞、結構層面觀察；皮脂、天然保濕因子、神經酰胺等為皮膚成分測量指標；TEWL、皮膚pH、皮損評分等是進行皮膚屏障功能評估的常用無創性指標［15-16］。

完整的皮膚屏障是皮膚作為物理和免疫屏障的先決條件［17］。皮膚屏障功能的破壞作為AD發病的一個重要原因，不但引起水分丟失導致皮膚干燥、瘙癢，還使皮損部位對外界化學物質或病原體侵害刺激更敏感，促使炎癥反應的發生，造成慢性、持續性皮膚炎癥［18-19］，繼而加重皮膚屏障功能損傷，形成惡性循環。以改善皮膚屏障功能為出發點的研究可能是打破AD惡性循環的重要突破口［20］。隨著AD研究的深入，中醫藥對皮膚屏障功能的修復作用也越來越受到重視［21］。

中醫學認為，AD多因先天稟賦不足、胎毒遺熱或后天調攝不當，脾失健運，生濕化熱，復感風濕熱邪，蘊結肌膚，內外合邪而發病［22］，具有從急性期向慢性期轉化并逐漸呈慢性的特征。從中醫證候類型來看，以風濕熱蘊證、濕熱內蘊證（或濕熱蘊結證）、脾虛濕盛證、血虛風燥證最為常見，發病初期或急性發作期以風濕熱蘊、濕熱內蘊（或濕熱蘊結）、脾虛濕盛為主，久則血虛風燥，肌膚失養［23-24］。而AD皮損評分和TEWL從高到低依次為濕熱蘊結＞脾虛濕蘊＞血虛風燥，且濕熱蘊結證型以皮損紅斑、丘疹、滲液為主要表現，其皮膚屏障功能損害最為嚴重［25］。

麻黃連軺赤小豆湯出自《傷寒論》，主治濕熱發黃兼表邪未解者，由麻黃、連軺、赤小豆、生梓白皮、杏仁、生姜、炙甘草、大棗組成。方中連軺，現今臨床多由連翹代替，因而也被稱為麻黃連翹赤小豆湯。生梓白皮，后世醫家多以桑白皮、茵陳等替代，實踐證明行之有效［26］。現今臨床廣泛應用本方治療特應性皮炎、濕疹及過敏性疾病，證屬濕熱熏蒸于表者［6，27］。如周芳等［28］報道用麻黃連軺赤小豆湯加減治療青少年及成人特應性皮炎，可明顯改善AD皮損及瘙癢，療效優于開瑞坦；國醫大師禤國維在治療特應性皮炎時，也強調及早修復皮膚免疫防御功能的重要性［29］；本課題組常用本方治療特應性皮炎、濕疹等皮膚病，屢獲良效。但目前有關麻黃連軺赤小豆湯治療AD的效應機制，僅有抗變態反應等相關研究，如陳建等［30］發現本方可抵抗組胺引起的瘙癢、抑制IgE產生和肥大細胞脫顆粒，研究尚待深入。

本課題組為觀察麻黃連軺赤小豆湯防治AD的療效及其效應機制，確定其治療最佳時機，根據半抗原DNFB反復刺激皮膚建立AD小鼠模型的復制過程，結合不同時期AD的皮損特點，在造模開始第11、25、39、46天四個時間點進行動態觀測。結果表明：實驗初期模型小鼠急性發作，皮膚水腫潰爛結痂，急性進展期脫痂與瘢痕增生共現，亞急性期與慢性期表現為紅斑出血點、鱗屑或苔蘚樣變以及皮膚干燥；中藥麻黃連軺赤小豆湯和糠酸莫米松都能不同程度的改善皮損狀況，相比于糠酸莫米松，麻黃連軺赤小豆湯在亞急性期及慢性期的治療效果更為顯著且持久，可明顯緩解亞急性期及慢性期紅斑、出血點表現與皮膚干燥、鱗屑或苔蘚樣變，減少經皮水分散失，降低pH值，改善皮損病理損傷。

值得注意的是，與其他時期各干預組小鼠TEWL下降相比，糠酸莫米松組和麻黃連軺赤小豆湯組小鼠急性期（第1～11天）TEWL明顯升高；其次，AD慢性進展階段（第39天以后），各組小鼠皮膚pH差異不明顯。AD不同進展階段其主要病理表現不同，實驗初期，AD模型以皮膚水腫、潰爛為主，進而結痂，麻黃連軺赤小豆湯作為表里雙解之劑，在內健脾和中清熱利濕，在外發散風濕熱邪，麻黃、杏仁調肺發表之功，可促進皮膚津液宣發輸布，加速AD皮損水腫、潰爛進程，故而TEWL明顯升高；而糠酸莫米松凝膠質地滋潤，在治療AD皮損的同時，亦可在水腫、潰爛皮損表面形成更加濕潤的保護膜，故而糠酸莫米松組小鼠皮損TEWL亦升高。實驗中后期，AD模型小鼠主要以皮膚干燥鱗屑樣改變為主要皮損表現，出血、結痂、瘢痕增生等癥狀不明顯，故而pH變化不顯著。

綜上所述，麻黃連軺赤小豆湯可有效改善AD模型小鼠皮膚屏障，以亞急性期效果最佳。在此基礎上，我們后續將進一步從皮膚屏障組成如絲聚蛋白（filaggrin，FLG）、兜甲蛋白（loricrin，LOR）、內披蛋白（involucrin，IVL）和神經酰胺1（Ceramide 1，Cer 1）、Cer 3等角度，探討麻黃連軺赤小豆湯改善皮膚屏障功能的相關效應機制，并將進行拆方研究，從AD“內外竄擾”發病環節探討“表里雙解”之麻黃連軺赤小豆湯防治AD的效應機制。