大蒜素對大鼠血管平滑肌細胞遷移的影響及機制研究*

李雯靜，黃麗雯

武漢科技大學附屬天佑醫院，湖北 武漢 430064

支架內再狹窄是經血管介入治療后的一種常見并發癥［1］。據統計，在血管介入治療并成功植入藥物洗脫支架的心腦血管疾病患者中，支架內再狹窄發生率約為10%［2］。支架內再狹窄的病理進程中，位于血管中膜的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的遷移和增殖發揮著重要的作用［3］。VSMC在細胞因子及炎癥因子等的誘導下，從血管中膜遷移至內膜并進行大量增殖從而引起內膜新生是支架內再狹窄發生的重要機制之一［4］。因此，有效抑制VSMC遷移是預防支架內再狹窄的有效方法。大蒜素是大蒜的主要活性成分，具有多種生物學活性。研究發現，大蒜素在抑制炎癥反應及抗腫瘤細胞遷移等方面具有顯著作用［5-7］。動物實驗顯示，大蒜素可以減輕支架內再狹窄［8-9］，但其作用機制卻未見報道。因此，本研究旨在從NF-κB信號通路出發闡明大蒜素發揮抑制血管再狹窄的作用機制。

1 材料

1.1 動物4周齡SPF級SD雄性大鼠5只，體質量100～140 g，購自湖北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，飼養于SPF級環境中，溫度為25℃，相對濕度為50%，12 h光照／12 h黑暗，噪音在80 dB以下。本研究已獲得武漢科技大學附屬天佑醫院倫理委員會批準，批準編號：WKDTY20190703。

1.2 藥物與試劑大蒜素（純度≥98%，德國默克公司，貨號：17795-26-5）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔IgG（H+L）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體、平滑肌細胞標志蛋白（α-smooth muscle actin，α-SM-actin）兔多克隆抗體、極超敏ECL化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：ST1470、P0010S、A0208、AF1186、AF0048、P0018FS）；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁化學研究所，貨號：CK04）；核轉錄因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）兔單克隆抗體、p-NF-κB p65兔單克隆抗體（美國CST公司，貨號：8242、3033）；DMEM／F12培養基（美國Hyclone公司，貨號：SH30023.01）；類胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號：70220-8611）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-R2856c、E-EL-R0015c）。

1.3 儀器SW-CJ-2FD型超凈工作臺（吳江市博士凈化設備有限公司）；BXFM型顯微鏡（日本Olympus Corporation公司）；Incubator 3131型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；HNY-100D型溫控搖床（長沙三利儀器儀表有限公司）；Infinite M200 Pro型酶標儀（瑞士TECAN公司）；Neofuge 18R型離心機（力康生物醫療科技控股有限公司，離心半徑：9 cm）；Mini-PROTEAN Tetra型電泳儀、Mini-Trans-Blot型電轉儀、ChemiDoc MP型化學發光成像系統、Image Lab 6.0成像系統（美國Bio-Rad公司）；Image J 1.51w軟件（美國國立衛生研究院）。

2 方法

2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細胞的分離培養和鑒定

根據文獻［10］所述，獲取大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞，并采用組織塊貼壁法進行培養，用抗大鼠α-SM-actin抗體進行免疫熒光染色鑒定，確定為VSMC。細胞純度達到95%以上的第3代至第5代VSMC用于后續實驗。

2.2 CCK-8檢測細胞活力調整VSMC密度為2.0×105mL-1，接種于96孔板中，每孔100μL。待細胞生長融合至80%時，將細胞饑餓處理24 h。采用100μL含 不 同 濃 度（5μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、60μmol·L-1、80μmol·L-1、100μmol·L-1）大蒜素或0.1%DMSO（對照組）的無血清DMEM／F12培養基培養細胞，每個濃度設置6個復孔。24 h后棄去培養液，每孔加入100μL含10% CCK-8試劑的無血清培養液繼續培養2 h，使用酶標儀檢測各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

2.3 細胞劃痕實驗調整VSMC密度為2.0×105mL-1，每孔1.5mL，接種于6孔板中。待細胞融合至100%時，更換無血清培養液饑餓處理24 h。使用1 mL的移液槍頭豎直在各組培養皿底壁劃一個“十”字形劃痕，使用PBS沖洗2次后在顯微鏡下拍取劃痕圖片，記為0 h劃痕。將細胞分為對照組、模型組及大蒜素組，對照組加入1.5 mL含1%類胎牛血清的培養液，模型組加入1.5mL含1%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養液，大蒜素組加入1.5 mL含1%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養液，繼續培養48 h，顯微鏡下觀察相同位置，拍取劃痕圖片，記為48 h劃痕。使用Image J軟件統計各組劃痕面積，計算各組細胞的遷移率。實驗重復3次。

細胞遷移率＝［劃痕面積（0 h）-劃痕面積（48 h）］／劃痕面積（0 h）

2.4 Transwell實驗將VSMC分為對照組、模型組及大蒜素處理組。采用無血清培養液將VSMC密度調整為3.0×105mL，在Transwell培養板上室加入200μL細胞懸液。對照組下室加入600μL含有10%類胎牛血清FBS的培養液，模型組下室加入600μL含有10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養液，大蒜素組下室加入600μL含有10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養液。培養18 h后取出小室，PBS小心沖洗3次，每次5 min，將上室底部內面未穿過的細胞輕輕擦去，4 ng·L-1多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗3次，使用1 mg·L-1DAPI在室溫下避光染色2 min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下拍取被染色的細胞核的代表性圖片，使用Image J軟件進行細胞計數。實驗重復3次。

2.5 Western Blot檢測蛋白表達根據文獻［11］所述進行操作，具體如下：將細胞分為對照組、模型組和大蒜素組，待3組細胞融合至50%時，更換無血清培養液饑餓處理24 h，對照組給予含10%類胎牛血清的培養基，模型組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養基，大蒜素組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養基，培養24 h后提取各組細胞總蛋白，根據BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明書測定各組蛋白濃度，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。取等量蛋白質進行上樣，電泳、電轉后室溫封閉2 h。加抗NF-κB p65（1∶1 000）、抗p-NF-κB p65（1∶1 000）、抗GAPDH一抗（1∶1 000），4℃水平搖床中孵育過夜。PBST洗滌3次，每次5 min；加入HRP標記的二抗（1∶4 000），室溫孵育1～2 h。然后放入化學發光成像系統，滴加按等體積配好的化學發光試劑A液和B液，打開Image Lab成像系統拍取圖像，通過軟件測定各蛋白條帶的灰度值，然后進行半定量分析。

2.6 ELISA法測定細胞培養液中TNF-α、IL-6含量將細胞分為對照組、模型組和大蒜素組，待三組細胞融合至50%時，更換無血清培養液饑餓處理24 h，對照組給予含10%類胎牛血清的培養基，模型組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS的培養基，大蒜素組給予含10%類胎牛血清+1 mg·L-1LPS+40μmol·L-1大蒜素的培養基，繼續培養24 h后收集各組細胞培養液，4℃、3 000 r·min-1離心去除細胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-6的水平。每組設6個復孔。

2.7 統計學方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學差異。

3 結果

3.1 大蒜素對VSMC活力的影響與對照組比較，大蒜素濃度為80μmol·L-1和100μmol·L-1時，VSMC活力明顯減弱（P＜0.05）；當大蒜素濃度≤60μmol·L-1時，對VSMC活力無明顯影響（P＞0.05），故本實驗選取40μmol·L-1大蒜素進行后續實驗。見圖1。

圖1 大蒜素對血管平滑肌細胞活力的影響

3.2 大蒜素對VSMC遷移的影響細胞劃痕實驗結果顯示：與對照組比較，模型組VSMC遷移率顯著提高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組VSMC遷移率明顯降低（P＜0.01）。Transwell實驗結果顯示：與對照組比較，模型組穿出小室的細胞數顯著增多（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組穿出小室的細胞數明顯減少（P＜0.01）。見圖2。

圖2 大蒜素對血管平滑肌細胞遷移的影響

3.3 大蒜素對NF-κBp65和p-NF-κB p65蛋白表達的影響與對照組比較，模型組p-NF-κB p65／NF-κB p65的水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組p-NF-κB p65／NF-κB p65的水平明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 大蒜素對各組細胞內p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達的影響

3.4 大蒜素對VSMC培養液中炎癥因子水平的影響與對照組比較，模型組細胞培養液中TNF-α和IL-6的水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素組細胞培養液中TNF-α和IL-6的水平顯著降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 大蒜素對VSMC培養液中炎癥因子水平的影響

4 討論

持續性炎癥反應可通過促進VSMC的遷移和增殖在不良的血管重塑、血管增生或閉塞性疾病（包括動脈粥樣硬化、支架內再狹窄和靜脈移植失敗）中起關鍵作用［12］。本研究考察了大蒜素在LPS介導的大鼠胸主動脈VSMC遷移中的潛在作用，發現大蒜素可顯著抑制VSMC遷移能力，同時可明顯降低VSMC培養液中炎癥因子TNF-α和IL-6的濃度，抑制VSMC內NF-κB p65磷酸比。

經皮腔內血管成形術、支架植入術及搭橋術等在內的介入或外科手術均可通過恢復嚴重狹窄或閉塞血管的血供有效改善患者預后［13-14］。然而，隨著術后時間的延長，機體的炎癥反應及其誘導的VSMC遷移至血管內膜并大量增殖常會導致血管再次狹窄甚至重新閉塞［15-17］。研究顯示，血管壁的損傷可誘導多種促細胞遷移的炎癥介質表達，而有效抑制血管壁損傷后的炎癥反應，可明顯減弱血管內VSMC遷移至內膜及過度增殖，從而起到抑制內膜新生的作用，降低血管再狹窄或閉塞的發生率［18-19］。

大量研究證實，VSMC過度遷移至內膜是導致血管再狹窄的重要因素［20-22］。因此，準確檢測VSMC細胞的遷移能力對判定血管再狹窄具有重要意義。目前，關于檢測VSMC遷移水平的方法有很多，最常用的是細胞劃痕實驗和Transwell實驗。本研究中，通過細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測發現，VSMC細胞經LPS誘導后其遷移能力明顯增強，而大蒜素可明顯減弱VSMC細胞的遷移能力。推測大蒜素對VSMC遷移引起的血管再狹窄具有緩解作用。

NF-κB信號通路是介導炎癥反應的經典通路［23-25］，NF-κB蛋白常以p65和p50亞基形成同源／異源二聚體的形式存在，并在細胞質中與抑制蛋白IκB結合形成三聚體復合物而處于失活狀態［26］。當受到炎癥相關誘導因素刺激后，信號將傳遞給IKK激酶（IκB kinase），使IκB蛋白磷酸化并從三聚體中解離出來，NF-κB二聚體暴露出核定位序列并被磷酸化，并迅速從細胞質進入細胞核內，與核內DNA上的特異序列結合，促進炎癥相關基因的轉錄，如TNF-α和IL-6等［27-28］。研究顯示，NF-κB信號通路介導的炎癥反應參與血管再狹窄的發生和病理進展［29-30］，在損傷的大鼠血管增生內膜中可檢測到NF-κB活性增強［31］。抑制NF-κB信號通路活性可減輕VSMC及血管內膜炎癥反應，并最終抑制損傷血管再狹窄的嚴重程度［3］。本研究顯示，體外LPS誘導后，VSMC中NF-κB p65的磷酸化水平顯著升高，并增加其下游炎癥因子（包括IL-6，TNF-α）的表達，同時VSMC遷移活性也增強。這些結果表明，NF-κB信號通路介導的炎癥反應在VSMC遷移中起重要作用。此外，我們在LPS刺激的基礎上加入大蒜素處理VSMC后發現，大蒜素的干預可降低NF-κB p65磷酸化，同時炎癥因子（包括IL-6，TNF-α）的表達減弱；進一步檢測VSMC的遷移活性發現，VSMC的遷移受到抑制。

綜上，大蒜素可顯著抑制LPS誘導的血管平滑肌細胞遷移，其作用機制與抑制NF-κB p65的磷酸化相關。