紅景天苷對低氧性肺動脈高壓小鼠心功能的影響*

趙白信，于慧娟，焦方杰，邢麗麗，黃蕾，張艷，段少博，姚輝梅

1.鄭州市第七人民醫院，河南 鄭州 450016；2.鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052；3.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是指因缺氧引起的平滑肌細胞異常增殖及血管重塑而導致肺小動脈病變及肺動脈壓力升高，最終發展為右心衰竭，嚴重威脅患者的生命安全［1-2］。HPH發病初期較為隱匿，容易被忽視，其臨床診斷需依靠右心導管檢查，但右心導管檢查具有一定的創傷性且對醫生技術有較高的要求，臨床普及性有限。超聲心動圖作為一種安全、無創、可重復性強的檢測方式，可間接評估肺動脈壓力，對HPH的診療及預后評估有重要意義［3-5］。在HPH的進展過程中，肺血管重塑是其重要的病理環節，而炎癥反應是肺血管重塑的重要驅動因素［6］。因此，減輕炎癥反應，抑制肺血管重塑是延緩HPH進展的關鍵。紅景天苷是草本植物紅景天的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化應激、抗病毒、抗腫瘤作用［7-8］。研究表明，紅景天苷能舒張血管平滑肌，抑制高血壓大鼠的血管重塑，發揮心血管保護作用［9］。目前，紅景天苷與肺心病的相關性研究較多，但關于其對HPH小鼠心功能的影響及其作用機制尚未明確。因此，本研究建立HPH小鼠模型，探討紅景天苷對HPH小鼠心功能的影響及作用機制，旨在為紅景天苷治療HPH提供理論支持與實驗證據。

1 材料

1.1 動物50只雄性C57BL／6小鼠，8周齡，體質量18～22 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養在溫度（22±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h／12 h明暗交替環境中，自由飲水進食。本研究在實施前已獲得鄭州大學動物倫理委員會批準，倫理批號：20180006。

1.2 藥物與試劑紅景天苷（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，貨號：B20504）；逆轉錄試劑盒（上海玉博生物科技有限公司，貨號：205111）；BCA蛋白定量試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨號：80816-500）；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：DA1015D、SEKR-0009、SEKR-0005、G1120）；核轉錄因子-κB（（nuclear factor kappa B，NF-κB）、p-NF-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）、p-p38 MAPK一抗及HRP標記的羊抗兔二抗（美國Abcam公司，貨號：ab223343、ab141406、ab195049、ab278674、ab6728）。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成設計。

1.3 儀器ABIViiA TM7型實時熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司）；Elx 800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；SLP-2600型石蠟切片機、DM8000M型光學顯微鏡（德國徠卡公司）；GE VOLUSON S6型彩色多普勒超聲診斷系統（美國通用電氣公司）；Allegra X-12型離心機（貝克曼庫爾特中國有限公司，離心半徑：10 cm）。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備及藥物干預50只雄性C57BL／6小鼠按體質量分為對照組、模型組及紅景天苷高（200 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1）劑量組，每組10只。除對照組外，其余小鼠依據參考文獻的方法建立HPH模型［10-11］，具體如下：將小鼠置于常壓低氧艙內，O2濃度維持10%，CO2濃度＜5%，以無水氯化鈣控制倉內水蒸氣，每天8 h，每周6 d，維持4周，其余時間同對照組處于同一環境中（常溫常壓及正常的O2濃度和CO2濃度）。紅景天苷高、中、低劑量組小鼠入倉前30 min腹腔注射20 mL·kg-1紅景天苷溶液，每天1次，每周6次，維持4周［12］，對照組和模型組予以腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2 超聲心動圖檢測末次腹腔注射24 h后實施超聲心動圖檢查，檢測小鼠右心結構與功能。采用體積分數10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取左側臥位及仰臥位采集圖像，12S探頭，rodent模式，二維超聲檢查心臟結構，于左心室短軸乳頭肌水平測量偏心指數（eccentricity index，EI），心尖四腔切面舒張期測量右心室壁厚度（right ventricular wall thickness，RVWT）、右室基底段內徑（right ventricular diameter，RVD）、右室面積變化率（right ventricular fractional area change，RVFAC）。檢測完成后轉化頻譜為多普勒模式，于胸骨旁主動脈根部短軸切面肺動脈瓣口處測量肺動脈瓣峰值血流速度（plumonary arterial velocity，PAV）及肺動脈血流加速時間（acceleration time，AT）。

2.3 右心導管法檢測平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial presure，m PAP）及右心室收縮壓（right ventricular systolic presure，RVSP）超聲心動圖測量完畢后，取仰臥位，將小鼠四肢固定于木板，分離右側頸外動脈，PE導管經壓力傳感器鏈接PowerLab生理記錄儀，另一端經頸外靜脈緩慢插入右心室，再進入肺動脈，記錄mPAP及RVSP，其中1 kPa＝7.5 mm Hg。

2.4 ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α水平斷頭法處死小鼠，留取血液1 mL，室溫下靜止1 h，3 000 r·min-1離心15min，取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清IL-6、TNF-α含量。

2.5 肺動脈血管組織病理學觀察取小鼠肺組織，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成厚度4μm的切片，HE染色，于顯微鏡下觀察肺動脈血管組織的病理變化。

2.6 右心肥大指數（right ventricular hypertrophy

index，RVHI）檢測PBS緩沖液沖洗干凈心臟，剪開心房，沿室間隔將心臟分離成右心室、左心室和室間隔，稱量右心室（right ventricle，RV）、左心室（left ventricle，LV）及室間隔（ventricular septum，S）的質量，計算RVHI。

RVHI＝RV／（LV+S）

2.7 RT-qPCR檢測肺組織NF-κB m RNA、p38MAPK m RNA的相對表達量每組選取5只小鼠肺組織，Trizol法提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄得到cDNA，RT-qPCR檢測相關基因的表達水平。按照試劑盒說明書設定反應體系，反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性25 s，60℃退火35 s，72℃延伸55 s，反應40個循環，再次72℃延伸8 min。GAPDH為管家基因，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8 Western Blot檢測肺組織中p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB、p-NF-κB蛋白的相對表達量取肺組織，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，PBS洗滌后加入二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，洗膜后化學發光顯影，Image Lab凝膠圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶GAPDH的灰度的比值表示目的蛋白相對表達水平。

2.9 統計學方法采用SPSS 26.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 紅景天苷對HPH小鼠超聲心動圖指標的影響與對照組比較，模型組小鼠的RVWT、RVD顯著升高（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠的RVWT、RVD顯著降低（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠的RVWT、RVD顯著升高（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠RVWT、RVD顯著升高（P＜0.05），EI、RVFAC、PAV、AT顯著降低（P＜0.05）。提示紅景天苷能顯著改善HPH小鼠的超聲心動圖指標，且呈明顯的劑量依賴性。見表2。

表2 紅景天苷對HPH小鼠超聲心動圖指標的影響 （±s，n＝10）

表2 紅景天苷對HPH小鼠超聲心動圖指標的影響 （±s，n＝10）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

組別 EI／% RVWT（l／mm） RVD（r／mm） RVFAC／% PAV（v／m·s-1） AT（t／s ）30±0.05 26.32±3.20模型組 70.44±4.90a 1.40±0.22a 4.92±0.44a 0.40±0.02a 0.98±0.04a 14.23±1.56a紅景天苷高劑量組 92.01±5.33b 0.68±0.15b 3.51±0.23b 0.52±0.03b 1.20±0.06b 23.01±2.80b紅景天苷中劑量組 84.32±4.85bc 0.85±0.17bc 3.90±0.33bc 0.48±0.03bc 1.13±0.05bc 20.23±2.54bc紅景天苷低劑量組 76.01±5.01bcd 1.11±0.18bcd 4.30±0.35bcd 0.44±0.04bcd 1.05±0.05bcd 16.33±2.29對照組 98.36±6.62 0.55±0.12 3.22±0.25 0.57±0.04 1.bcd

3.2 紅景天苷對HPH小鼠mPAP、RVSP、RVHI的影響與對照組比較，模型組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠的mPAP、RVSP、RVHI顯著升高（P＜0.05）。說明紅景天苷能改善HPH小鼠的心肺功能。見表3。

表3 紅景天苷對HPH小鼠m PAP、RVSP、RVHI的影響 （±s，n＝10）

表3 紅景天苷對HPH小鼠m PAP、RVSP、RVHI的影響 （±s，n＝10）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

?

3.3 紅景天苷對HPH小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平顯著升高（P＜0.05）。說明紅景天苷能降低HPH小鼠的炎癥因子水平。見表4。

表4 紅景天苷對HPH小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響 （±s，ng·L-1）

表4 紅景天苷對HPH小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響 （±s，ng·L-1）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

組別 n IL-6 TNF-α 10 18.22±3.25 38.54±4.23模型組 10 59.63±5.28a 142.32±8.89a紅景天苷高劑量組 10 26.35±4.35b 50.32±6.01b紅景天苷中劑量組 10 34.01±4.50bc 82.35±7.48bc紅景天苷低劑量組 10 45.30±5.02bcd 102.42±7.85對照組bcd

3.4 紅景天苷對HPH小鼠肺動脈血管組織病理變化的影響對照組小鼠肺小動脈血管壁薄，形態、管腔正常，結構清晰；模型組小鼠肺小動脈血管管壁增厚，管腔變窄，周圍大量炎癥細胞浸潤，有血管重塑表現；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠肺小動脈組織病理變化程度呈劑量依賴性減輕。說明紅景天苷能明顯逆轉HPH小鼠的肺動脈血管組織病理變化。見圖1。

圖1 紅景天苷對HPH小鼠肺動脈血管組織病理變化的影響（HE染色，×200）

3.5 紅景天苷對HPH小鼠肺組織NF-κBmRNA、p38MAPK mRNA表達水平的影響各組小鼠肺組織中NF-κB mRNA、p38MAPK mRNA相對表達量無明顯差異（P＞0.05）。見表5。

表5 紅景天苷對HPH小鼠肺組織NF-κB mRNA、p38MAPK m RNA表達水平的影響（±s，n＝5）

表5 紅景天苷對HPH小鼠肺組織NF-κB mRNA、p38MAPK m RNA表達水平的影響（±s，n＝5）

mRNA對照組組別 NF-κB mRNA p38MAPK 0.85±0.23 1.11±0.25模型組 0.82±0.23 1.20±0.25紅景天苷高劑量組 0.88±0.25 1.08±0.26紅景天苷中劑量組 0.84±0.24 1.13±0.28紅景天苷低劑量組0.86±0.22 1.15±0.25

3.6 紅景天苷對HPH小鼠肺組織p-NF-κB、NF-κB、p-p38MAPK及p38MAPK蛋白表達的影響與對照組比較，模型組小鼠肺組織p-NFκB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB／NF-κB、pp38MAPK／p38MAPK的水平顯著降低（P＜0.05）；與紅景天苷高劑量組比較，紅景天苷中、低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著升高（P＜0.05）；與紅景天苷中劑量組比較，紅景天苷低劑量組小鼠肺組織p-NF-κB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著升高（P＜0.05）。說明紅景天苷能抑制HPH小鼠肺組織中NF-κB、p38MAPK的磷酸化。見圖2，表6。

圖2 Western Blot檢測p-NF-κB、NF-κB、p-p38MAPK及p38MAPK蛋白表達

表6 紅景天苷對HPH小鼠肺組織p-NF-κB、NF-κB、p-p38M APK及p38M APK蛋白表達的影響 （±s，n＝5）

表6 紅景天苷對HPH小鼠肺組織p-NF-κB、NF-κB、p-p38M APK及p38M APK蛋白表達的影響 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與紅景天苷高劑量組比較，c P＜0.05；與紅景天苷中劑量組比較，d P＜0.05

B p-p38MAPK／p38MAPK對照組組別 p-NF-κB／NF-κ 0.15±0.04 0.08±0.02模型組 0.95±0.15a 0.80±0.15a紅景天苷高劑量組 0.22±0.08b 0.15±0.05b紅景天苷中劑量組 0.42±0.10bc 0.32±0.10bc紅景天苷低劑量組 0.65±0.13bcd 0.50±0.12 bcd

4 討論

HPH的肺血管病變主要局限于細小動脈，血管內膜平滑肌細胞增生導致管壁增厚、管腔狹窄，肺周圍阻力增加，進而出現肺循環淤阻及右心衰竭［13］。炎癥介質介導的肺毛細血管管壁通透性增加，肺血管結構破壞，血管內皮收縮、舒張因子失衡是導致肺血管阻力升高和血管重塑的重要原因［14］。因此，阻斷炎癥反應介導的病理變化，抑制肺血管重塑，成為治療HPH的重要環節。目前雖有內皮素受體拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑等靶向抗血管擴張藥物可減輕HPH的肺血管阻力，但價格昂貴；而其他糖皮質激素、免疫制劑等抗炎藥物的不良反應多［15-16］。近年來，隨著中醫藥學的發展，紅景天苷作為中藥紅景天的主要有效成分，在降壓、抗炎、增強免疫、保護心血管方面的作用逐漸被認知，為HPH的治療提供了新的研究方向。

藏藥紅景天具有抗炎、抗衰老、免疫調節、清除自由基、增強免疫力、保護心血管等多種藥理作用，廣泛用于一氧化碳中毒遲發性腦病、急性腦梗死等疾病的治療，在改善血液循環、抑制血小板聚集、保護神經細胞方面有顯著的優勢［17-21］。紅景天苷為紅景天的主要化學成分，能下調肺組織中TNF-α、IL-1的表達，改善HPH大鼠肺動脈壓、頸動脈壓與心肺功能［22］。Wei等［23］研究發現，紅景天苷可抑制大鼠局灶性腦缺血后的炎癥信號通路，減輕炎癥及氧化應激反應，改善腦缺血。另外，紅景天苷還可抑制高糖誘導的血管平滑肌細胞過度增殖，機制可能與抑制線粒體分裂有關［24］。以上研究均證實，紅景天苷具有抑制肺組織炎癥和血管內皮細胞增殖、降壓、改善血液循環的作用。本研究顯示，與模型組比較，紅景天苷給藥組小鼠RVWT、RVD、mPAP、RVSP、RVHI及血清IL-6、TNF-α水平顯著降低，而EI、RVFAC、PAV、AT顯著升高，肺動脈血管組織病理變化明顯減輕，且作用效果呈劑量依賴性。提示，紅景天苷可改善HPH進展過程中小鼠的右心結構及功能，降低炎癥水平，抑制肺血管的重塑。

p38MAPK／NF-κB是與炎癥反應調控機制密切相關的信號通路。p38MAPK能通過轉錄因子磷酸化發揮作用，參與炎癥反應及細胞凋亡、分化的細胞周期過程［25］。研究證實，p38MAPK在受到各種刺激時可迅速磷酸化，促進相關底物的活化，介導炎癥反應的發生［26］。NF-κB是在成熟B淋巴細胞中發現的重要核轉錄因子，可調控多種細胞因子、黏附分子和趨化因子的表達，從而調節機體的炎癥反應［27］。You等［28］認為磷酸化的NF-κB參與肺動脈平滑肌細胞的增殖。本研究顯示，與模型組比較，紅景天苷高、中、低劑量組小鼠肺組織中p-NFκB／NF-κB、p-p38MAPK／p38MAPK的水平顯著降低，且呈明顯的劑量依賴性。

綜上所述，紅景天苷可顯著改善HPH小鼠的心臟功能，減輕炎癥反應，其作用可能與抑制p38MAPK、NF-κB蛋白磷酸化有關。