HPLC法測定葉酸原料中光學異構體的含量

趙琦，鄒云紅，李永貴*，孫清*

(1.山東省榮軍總醫院，山東 濟南 250014；2.山東省藥學科學院，山東省化學藥物重點實驗室，山東 濟南 250101)

葉酸(folic acid)是B族維生素的一種，又稱維生素B9、維生素Bc、維生素M，是一種抗貧血及預防新生兒出生缺陷的藥物[1-3]。它集預防、治療和保健于一身，是機體細胞生長和繁殖所必需的物質，在體內以四氫葉酸的形式起作用，參與嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和轉化。House等[4-9]對葉酸對婦女孕育生命及不良生育新生兒神經管畸形的發生方面做了研究，缺乏葉酸會引起神經缺陷、動脈硬化、高血壓、心血管疾病甚至癌癥等。

葉酸由蝶啶環、對氨基苯甲酸和谷氨酸組成，分子中含有手性結構，存在光學異構體D-葉酸。藥物的光學異構體在活性、代謝過程及藥理毒理學方面與藥物本身常常有顯著差異，為提高藥物活性、減小副作用，需要對藥物中的光學異構體進行分離研究[10]。國家藥品監督管理局藥品審評中心發布的《第一批擬不推薦參比制劑化藥品種藥學研究技術要求》(征求意見稿)中明確要求對葉酸片(0.4 mg)中光學異構體進行研究，但目前葉酸各國藥典標準中，均未提供葉酸光學異構體D-葉酸的檢測方法。本研究建立了高效液相色譜法測定葉酸中光學異構體D-葉酸的檢測方法，彌補了藥典缺陷，為藥典標準提供補充，更好的控制葉酸質量，保證葉酸的用藥安全[11-13]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津LC-20AT泵、SPD-M20A型PDA檢測器)；分析天平(Sartorius BT125D)；pH計(梅特勒 SevenExcellence)；超純水機(上海杲森儀器設備有限公司)。

1.2 試藥 D-葉酸對照品(KLSSstandards 純度：96.46%)；葉酸(河北冀衡集團有限公司)；甲醇(山東禹王實業有限公司，色譜純)；乙腈(天津賽孚瑞科技有限公司，色譜純)；三乙胺(天津大茂化學試劑廠，分析純)；乙酸(天津市富宇精細化工有限公司，分析純)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為大賽璐QN-AX手性色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-乙腈-乙酸-三乙胺(50∶50∶2∶3)，流速0.6 mL·min-1；檢測波長為280 nm，柱溫為35 ℃，進樣體積20 μL[14]。

2.2 樣品制備 配樣溶劑：3%三乙胺甲醇溶液。

D-葉酸對照品溶液：精密稱取D-葉酸對照品約10 mg置100 mL量瓶中，加配樣溶劑適量使溶解，用配樣溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為D-葉酸儲備液。精密量取D-葉酸儲備液1 mL置100 mL量瓶中，加配樣溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取葉酸約10 mg置50 mL量瓶中，加配樣溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3 專屬性試驗 分別取“2.2”項下配樣溶劑、對照品溶液、供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。結果表明，在本檢測條件下，配樣溶劑對D-葉酸測無干擾，D-葉酸與葉酸分離良好。

A.配樣溶劑；B.D-葉酸對照品溶液；C.供試品溶液圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.4 定量限與檢測限 量取“2.2”項下對照品溶液，加配樣溶劑稀釋成不同濃度梯度的溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀，測得D-葉酸定量限為2.50 ng(S/N≈10)，檢測限為1.00 ng(S/N≈3)。

2.5 線性試驗 量取“2.2”項下葉酸對照品儲備液5 mL置100 mL量瓶中，用配樣溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性儲備液。分別精密量取線性儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL量瓶中，用配樣溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液1～5。精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以D-葉酸濃度C為橫坐標，D-葉酸峰面積A為縱坐標做線性回歸，求得回歸方程Y=87 137X-5 179，R2=0.999 8，說明D-葉酸濃度在0.249 7～1.997 4 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

圖2 D-葉酸峰面積與濃度線性關系圖

2.6 溶液穩定性試驗 取“2.2”項下對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。結果D-葉酸平均峰面積為81 122，RSD為0.99%，說明D-葉酸對照品溶液24 h內穩定。

2.7 儀器精密度試驗 量取“2.2”項下D-葉酸對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄色譜圖中D-葉酸峰面積A，結果D-葉酸平均峰面積為80 277，RSD為0.63%，表明儀器精密度良好。

2.8 回收率試驗 精密量取“2.2”項下D-葉酸對照品儲備液0.8、1.0、1.2 mL(約相當于D-葉酸限度的80%、100%、120%)置100 mL量瓶中，分別加入葉酸20 mg用配樣溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，各濃度平行配制3份，依法測定，計算回收率，結果見表1。

表1 D-葉酸回收率試驗結果(n=9)

2.9 樣品檢測 取葉酸3批，按照“2.2”項下方法配制供試品及D-葉酸對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別取20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，按外標法計算，結果D-葉酸含量分別為0.049%、0.046%、0.043%。

3 討論

3.1 檢測波長選擇 對D-葉酸對照品溶液進行全波長掃描，結果顯示D-葉酸在280 nm波長處有最大吸收，因此選用280 nm檢測波長進行檢測。

3.2 配樣溶劑選擇 葉酸在水、乙醇、乙腈中溶解性差，在堿性溶液中易溶。研究過程中分別選用流動相、甲醇、乙腈、5%氨水溶液、四氫呋喃-甲醇-水-醋酸-三乙胺(10∶80∶10∶2.4∶3)、3%三乙胺甲醇溶液作為配樣溶劑，結果葉酸在流動相、甲醇、乙腈均不能完溶解，在5%氨水溶液、四氫呋喃-甲醇-水-醋酸-三乙胺(10∶80∶10∶2.4∶3)、3%三乙胺甲醇溶液中可以完全溶解。由于葉酸在3%三乙胺甲醇溶液中溶解快速且與流動相接近，因此最終選用3%三乙胺甲醇溶液作為最終配樣溶劑。

3.3 目前《歐洲藥典》《日本藥典》《美國藥典》《英國藥典》《中國藥典》等多國藥典均已收錄葉酸質量標準，但均未對葉酸光學異構體進行控制。本研究建立了高效液相色譜法測定葉酸異構體D-葉酸的檢測方法，并進行了方法學研究，結果表明該方法專屬性強，可用于檢測葉酸中異構體D-葉酸的含量。