丹酚酸B治療阿爾茨海默病的作用機制研究進展

李 建，李 強，李延峰，王洪權

(1. 赤峰學院附屬醫院神經內科， 內蒙古 赤峰 024000；2. 中國醫學科學院/北京協和醫學院北京協和醫院神經內科， 北京 100050；3. 航天中心醫院、北京大學航天臨床醫學院神經內科/航天醫學中心， 北京 100049)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 是最常見的一種神經變性病，以進行性腦功能失調為特征的疾病，表現為記憶、認知、語言和行為障礙以及人格改變等[1]。AD的典型病理特征為由beta-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ) 細胞外沉積形成的老年斑(senile plaques，SPs)和細胞內由tau蛋白過度磷酸化引起的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)[2]。AD目前沒有確切有效的治療方法，給社會和家庭帶來了沉重的經濟和精神負擔。

目前，AD中發病機制尚不清楚，主要的發病機制假說包括淀粉樣蛋白學說、氧化應激學說、線粒體功能障礙學說和膽堿能學說等，另外還有興奮毒性損傷學說、鈣學說等[3]。近年來研究顯示，天然化合物通過多種機制能夠抑制AD的發生，在AD中顯示出多靶點治療特性，成為近年AD治療有益的探索。丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)是從丹參中提取的天然化合物，通過多種機制在AD中發揮神經保護作用。因此，本文將對近年來SAB在AD中的治療作用的實驗研究進行總結，闡述其對AD治療的相應機制，同時指出其臨床應用和將來的應用趨勢。

1 SAB的來源和藥理學特性

丹酚酸B為唇形科植物丹參(SalviaMiltiorrhizaBge) 的根及根莖提取而得。是丹參中含量最豐富、生物活性最強的水溶性化合物[4]。SAB分子式為C36H30O16，相對分子質量為718.62，該品為棕黃色干燥粉末。SAB為3分子丹參素與1分子咖啡酸縮合而成，是研究較多的丹酚酸之一，對心、腦、肝、腎等器官均具有重要藥理作用[4]。SAB具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等藥理作用[5]。近年來研究顯示，SAB在AD中通過多種機制對AD具有治療作用(Tab 1)。

2 SAB在AD中的神經保護作用機制

2.1 對Aβ的作用

2.1.1抑制Aβ產生 Aβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid-βprecursor protein，APP)經不同的分泌酶相繼切割生成[15-16]。APP的加工方式有兩種，即非淀粉樣蛋白生成途徑(non-amyloidogenic pathway)和淀粉樣蛋白生成途徑(amyloidogenic pathway)(Fig 1)。其中非淀粉樣蛋白生成途徑是指α-分泌酶(α-secretase)在APP的Aβ肽段內切割生成可溶性的胞外片段APPsα (soluble αAPP)和由99個氨基酸殘基組成的胞內段 CTFα (C terminus fragment α，C83)，再由γ-分泌酶(γ-secretase)切割CTFα生成p3片段和APP胞內結構域AICD (amyloid precursor protein intracellular cytoplasmic/C-terminal domain)片段。而淀粉樣蛋白生成途徑是指APP先由β-分泌酶(β-secretase)切割生成分泌到胞外的可溶性片段APPsβ (soluble βAPP)和由99個氨基酸殘基組成的胞內段CTFβ (C terminus fragment β，C99)，再由γ-分泌酶切割CTFβ產生留在胞內的大約50個氨基酸的AICD片段和釋放到胞外的不同長度的Aβ肽段。其中，β-淀粉樣蛋白前體蛋白切割酶-1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE-1)即β-分泌酶是Aβ生成步驟中的限速酶。

Tab 1 Summary of neuroprotective effect of salvianolic acid B in experimental AD model

Fig 1 Schematic representation of amyloid precursor protein (APP) processing pathways

研究顯示，SAB (25～100 μmol·L-1)能夠在轉染APPsw (APP Swedish mutant)的SH-SY5Y細胞中，通過降低BACE1表達減少Aβ1-40和Aβ1-41的產生[13]。ADAM10(anti-disintegrin and metalloprotease 10)具有α-分泌酶活性，屬于ADAM家族(即一種去整合素和金屬蛋白酶家族酶)。SAB上調ADAM10和sAPPα，而對APP和PS1(Presenilin-1) 的表達不產生影響，這表明SAB具有促進α-分泌酶的活性和抑制β-分泌酶的藥理學作用，具有調控α-分泌酶和β-分泌酶活性的雙重作用，從而減少Aβ的產生[13]。在轉染APPsw的N2a或H4細胞中，SAB劑量依賴性降低細胞外Aβ、APPsβ以及CTFβ (C99)生成，而不影響APP表達和α-分泌酶以及γ-分泌酶的表達[14]，進一步驗證了前人研究結果，即SAB是β-分泌酶抑制劑。體內研究也顯示，SAB能夠通過抑制BACE1和PS1來抑制Aβ的產生[17]。以上研究表明，SAB是β-分泌酶抑制劑，能夠通過抑制β-分泌酶活性從而減少Aβ的產生。但是，關于SAB對α-分泌酶以及γ-分泌酶表達影響的體內、外研究結果不統一，這可能與實驗模型選擇和檢測方法差異有關。

2.1.2抑制Aβ的聚集以及促進纖維狀Aβ的降解 早期電鏡研究發現，SAB(10～100 nmol·L-1)與Aβ1-40共孵育，可以抑制纖維化Aβ1-40生成[18]。進一步使用硫磺素T(thioflavin-T，Th-T)染色顯示，SAB抑制纖維化Aβ1-40的生成和促進纖維化Aβ的解聚[7]。Th-T是一種與淀粉樣纖維特異性結合而熒光顯著增強的染料，因而常被用來定性和定量檢測蛋白質和多肽纖維的生長，以及淀粉樣纖維聚集過程的檢測，是最常用的淀粉樣蛋白熒光探針。在發射波長482nm處，用ThT的方法檢測熒光強度，該熒光強度的強弱反映了Aβ的聚集程度，熒光越強說明聚集越明顯。通過Th-T染色方法發現，SAB(10～100 μmol·L-1)與Aβ1-40和Aβ1-42共孵育，能夠減少熒光強度，表明SAB能夠抑制Aβ的聚集，進一步透射電鏡研究發現SAB(10～100 μmol·L-1)能夠抑制纖維狀Aβ1-40(Aβ fibril)的形成，并促進纖維狀Aβ1-40的解聚[7]。而通過圓二色光譜(CD spectra)觀察顯示，SAB能夠抑制Aβ1-40片層結構(β-sheet)的形成[7]。而主要成分為SAB(含有2.21%SAB)的丹參水提物能夠抑制Aβ聚集[19]。以上研究表明，SAB能夠抑制Aβ的聚集以及促進纖維狀Aβ的降解，這也可能是其在AD中的神經保護作用機制之一。

2.1.3抑制Aβ誘導的氧化應激損傷和凋亡發生 SAB在AD中的神經保護作用研究最早源于中國醫學科學院藥物研究所張均田教授組的研究，他們發現在原代培養大鼠皮層神經元中，SAB能明顯增加細胞活力，降低Aβ1-40誘導的LDH釋放率，并劑量依賴地減少NO釋放[20]。在PC12細胞中，SAB抑制Aβ25-35誘導的ROS產生增加[21]。在Aβ25-35誘導的PC12細胞中，SAB通過抑制前列腺凋亡反應基因-4(prostate apoptosis response-4gene，par-4)的表達來抑制Aβ25-35誘導的PC12凋亡發生[8]。SAB通過抑制凋亡和ROS產生，抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷[9]。SAB能夠抑制Aβ25-35誘導的凋亡發生、鈣攝取增多和LDH釋放[10]。在體內，SAB(20和40 mg·kg-1)能夠抑制牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis，Pg)導致的ROS產生，促進抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的產生[17]。這表明在AD中，SAB具有抗氧化的藥理作用。

2.2 抗神經炎癥作用近年來研究顯示，神經炎癥(neuroinflammation)是AD的重要病理進程，促進Aβ和tau蛋白病理，參與AD發病機制[22]。許多細胞因子、腫瘤壞死因子、化學趨化因子、炎性小體等參與AD相關神經炎癥進程，促進AD發生[23]。而使用天然化合物通過抗炎機制對AD具有治療作用[24-25]。

SAB在AD同樣具有抗炎作用。小膠質細胞是中樞神經系統的免疫細胞，不同于外周和其他組織駐留的巨噬細胞。作為對中樞神經系統損傷(如神經元損傷或感染)的反應，小膠質細胞被激活以產生促炎因子(M1表型)或抗炎因子(M2表型)，在AD中，小膠質細胞的激活，能夠導致炎癥加重和疾病進展加速。而星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的細胞類型，它們對環境高度敏感，對CNS損傷迅速做出反應，它們還調節神經元的成熟并幫助維持其功能。星形膠質細胞對細胞因子和趨化因子等炎癥分子產生反應，并能夠感知如Aβ蛋白的聚集[26-28]。SAB能夠減少小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，另外，SAB能夠降低COX2和iNOS的表達以及TBARS產生[12]。最近的一項研究證明，SAB具有抗神經炎癥作用，在AD中發揮神經保護作用。研究顯示，AD病人腦中存在的牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgin givalis，Pg)能夠通過促進Aβ聚集，參與AD發病[17]。SAB(20,40 mg·kg-1)能夠降低Pg引起的IL-1β 和IL-6生成，升高腦內腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神經生長因子(nerve growth factor，NGF)的mRNA水平[17]。

2.3 SAB調控Nrf2/HO-1通路Nrf2系統與線粒體生物發生和線粒體質量控制正相關，活化的Nrf2直接或間接上調線粒體生物發生相關基因的表達，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活物1-α(PGC-1α)，從而促進線粒體發生，保護線粒體功能。SAB在AD中神經保護作用機制可能與其對線粒體保護和激活Nrf2/HO-1通路有關[21]。SAB對Aβ誘導的線粒體異常具有保護作用。 SAB可顯著減輕Aβ誘導的神經元內谷胱甘肽(GSH)和脂質氧化產生，并抑制線粒體過多的超氧化物生成。此外，SAB促進膜電位的恢復和ATP生成的增加，以及恢復細胞色素C氧化酶和F1F0-ATP合酶的活性。SAB減輕Aβ誘導的軸突線粒體斷裂和降低線粒體動力樣蛋白DLP1(dynamin-like protein 1) 的磷酸化。最后，SAB能夠恢復Aβ導致的神經元突觸密度的減低。總之，SAB具有調控線粒體功能，在AD中發揮神經保護作用[29]。而在APP/PS1轉基因小鼠中，SAB上調細胞核中Nrf2及HO-1蛋白表達，下調Keap-1蛋白表達，表明SAB具有激活Nrf2/HO-1通路的作用。

2.4 改善AD認知功能障礙最近研究顯示，SAB (10 mg·kg-1)口服給藥，能夠明顯改善Aβ25-35(10 nmol/5 μL)或東莨菪堿(scopolamine，SCO)誘導的小鼠認知功能障礙[11]。SCO (1 mg·kg-1)型膽堿受體拮抗劑，可阻斷大腦皮層和海馬區乙酰膽堿對M受體的激動作用，從而對記憶獲得產生阻抑效應，誘導癡呆發生。目前SCO已經被廣泛應用在評估神經營養藥物。腹腔給藥3 mg·kg-1后可造成動物記憶功能障礙，東莨菪堿用于誘導動物記憶障礙模型具有簡單、經濟、方便等優點，故常應用于抗AD活性化合物的初步篩選。進一步研究顯示，而GABAA型受體激動劑(muscimol or diazepam)拮抗SAB對小鼠認知功能障礙的改善作用，這表明，SAB可以通過GABA能神經遞質系統來改善膽堿能功能失調或Aβ25-35誘導的記憶損害[11]。最近研究顯示，SAB(10 mg·kg-1)能夠改善Aβ25-35誘導的小鼠認知功能障礙[12]。進一步機制研究發現，SAB抑制Aβ25-35誘導的膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)和腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的降低有關[12,30]。總之，SAB能夠在AD模型中發揮對認知的改善作用。

3 結語

綜上所述，SAB能夠通過抑制Aβ產生、聚集，促進Aβ清除，抑制Aβ誘導的氧化應激損傷和凋亡發生機制對AD具有治療作用。同時其可以保護線粒體，調控Nrf2/ARE通路，進而上調HO-1參與對AD的治療作用(Fig 2)。

Fig 2 Schematic representation of SAB-mediated neuroprotection in AD

目前臨床研究注冊網站(clinicaltrials.gov)有4項關于丹酚酸的臨床注冊研究，分別是對腦卒中、糖尿病、糖尿病周圍神經病和健康受試者的研究，其中3項是關于丹酚酸A的研究。而中國臨床試驗注冊中心(https://www.chictr.org.cn/index.aspx) 目前還沒有關于丹酚酸的臨床注冊研究。中國醫學科學院藥物研究所杜冠華研究員課題組關于國家1類新藥丹酚酸A片治療糖尿病周圍神經病變的II期多中心臨床試驗研究正在北京協和醫院開展之中。盡管目前研究顯示，SAB具有明確的抗AD作用，但是目前尚無關于SAB治療AD的臨床研究，鑒于丹酚酸的良好藥理作用，對于SAB在AD患者水平的治療探索研究值得期待。