有機磷農藥/有機磷神經性毒劑的蛋白加合物及其加合機制研究進展

王 瑾,孫鳳娟,王 飛,王紅梅,高潤利

(1.國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205; 2.陸軍裝備部裝備項目管理中心，北京 100072)

有機磷農藥(organophosphorus pesticides，OPP)和有機磷神經性毒劑(organophosphorus nerve agents，OPNAs)屬于有機磷領域中重要的兩類化合物，主要通過不可逆抑制膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)活性，使神經突觸內乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)過度蓄積，神經系統的傳導功能受損，進而產生一系列的毒害作用。OPP的毒性較低，因具有高效、便宜、對植物安全等優勢，用于殺蟲、滅菌、除草等。OPNAs是由OPP發展而來的具有速效致死性的膦酸酯類物質，典型代表有G類毒劑，如塔崩(GA)、沙林(GΒ)、梭曼(GD)、環沙林(GF)和V類毒劑，如維埃克斯(VX)，這些毒劑曾作為化學武器被應用于一戰、二戰和多次恐怖活動中[1-2]。

OPP和OPNAs可以通過呼吸道、皮膚黏膜、眼睛、胃腸道等多種途徑進入生物體，經過迅速的分布、代謝，最終以原體、代謝物、蛋白質加合物3種形式存在，并對生物體的健康產生短期或長期的影響，包括:①急性膽堿能毒性：蓄積的ACh對膽堿能受體(煙堿受體和毒蕈堿受體)過度刺激所產生的縮瞳、流涎、心動過急或過緩等癥狀；②中間綜合征：急性或重度的OP中毒引發的神經肌肉接頭功能障礙，如呼吸肌、骨骼肌麻痹；③遲發性神經病(organophosphate delayed neuropathy，OPIDN)：單次或反復暴露于OP毒物導致的遲發性中央-外周遠端感覺-運動多神經病，有感覺障礙、共濟失調、肌無力等表現；④慢性神經毒性：單次急性或多次低劑量暴露于OP毒物所引發的慢性神經行為改變，如學習記憶能力下降、情感障礙等[3]。

鑒于OPP/OPNAs的原體、代謝物在生物體內有穩定性差、存續時間短、降解速度快等諸多不足，OP毒性機制的研究焦點已經轉移至蛋白加合物。本文將諸多研究中涉及到的靶標蛋白分為兩類：內源性清道夫(丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)、白蛋白、轉鐵蛋白)和低劑量毒性的相關蛋白(細胞骨架蛋白、神經病靶標酯酶、泛素)，綜述OPP/OPNAs與這些靶蛋白之間的共價加合物、加合反應機理、活性位點的結構特征，旨在為OP毒物的確認暴露、溯源歸因、精準治療、合理預防等提供新的研究思路。

1 OPP/OPNAs中毒機制

OPP/OPNAs對生物體產生急性毒性作用的原因是AChE的活性被抑制。AChE主要分布于中樞神經系統的突觸內和外周神經系統的神經肌肉連接處，少量與血液中紅細胞的膜結合。它能夠快速水解神經遞質ACh，終止ACh對突觸后膜的興奮作用，從而保證神經信號在生物體內的正常傳遞[4]。此過程依賴于AChE的活性位點：催化三聯體(Ser203-His447-Glu334)和外周陰離子位點，底物ACh的季銨離子通過靜電作用結合在AChE的陰離子結合位點，其羰基碳與AChE的絲氨酸殘基Ser203的羥基相互作用，經乙酰化和去乙酰化循環水解ACh[5]。

作為ACh水解過渡態的結構類似物，OPP和OPNAs是AChE的高效抑制劑。OPP/OPNAs進入生物體后，磷原子與絲氨酸側鏈的羥基共價結合生成磷/膦酰化的AChE，使AChE喪失水解ACh的功能。與乙酰化的AChE能夠快速水解不同，磷/膦酰化的AChE的水解非常緩慢，致使AChE的活性受到抑制，ACh在體內過度蓄積并持續作用于膽堿能受體：毒蕈堿和煙堿受體，超過50%的AChE被抑制后會出現膽堿能危象，如嘔吐、腹痛、腹瀉、瞳孔縮小、多汗、流涎、心率減慢、肌肉痙攣等，嚴重者甚至會導致死亡[6]。

不同物種間或同一物種的不同部位間的AChE具有高度保守性，OP毒物對AChE的抑制作用與物種、年齡無關。OPP/OPNAs進入生物體后會迅速分布于各個器官如腦、肺、心、肝、腎，并穩定存在，其中肺的攝取率最高，這似乎間接解釋了為什么OP患者中毒死亡的直接原因是呼吸衰竭。此外，研究發現OP毒物的體循環量與AChE的濃度呈負相關，循環量過高會誘發膽堿能綜合征，伴有呼吸窘迫、高血壓等癥狀[7]。同時，神經元的鈣瞬變增加和鈣的高表達會造成神經元過度活化，進而導致神經元損傷，出現癲癇或永久性認知障礙。磷/膦酰化的AChE的重活化有兩種途徑：歷經緩慢的自發水解或活化劑的重活化。肟類重活化劑能夠復能磷/膦酰化ChE，與蓄積的ACh競爭膈肌煙堿型乙酰膽堿受體，從而保護呼吸肌纖維免受OP毒物的損傷[8-9]。此外，有研究發現其有擬膽堿酯酶作用，可水解ACh，但也存在諸多局限性：① 重活化作用具有選擇性：對敵敵畏、對硫磷、甲胺磷等中毒酶有較好的重活化作用，而對樂果、敵百蟲和馬拉硫磷等中毒酶的重活作用較差，GD中毒酶的重活效果更差[8]；② OP-AChE老化后AChE的活性不能再恢復，OPP/OPNAs與絲氨酸殘基之間的共價加合物易發生脫烷基形成單陰離子加合物，與OP毒物的磷原子上的取代基帶電性一致，阻礙了AChE的再活化進程；③ 常見的肟類藥物為季銨化合物，不易透過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，僅對外周組織中的AChE有重活化效果；④ 腎排泄快，需根據病情和半衰期重復給藥。目前，最有效的活化劑是親核吡啶鎓肟，但吡啶鎓環中的季氮原子帶有的永久性的正電荷會阻止肟穿過BBB，無法恢復大腦正常的膽堿能功能。研究發現[9]，叔肟單異亞硝基丙酮能激活中樞神經系統中的AChE，治療后患者具有更高的存活率和更低的發病率，但具體的活化作用還需進一步研究確認。

2 內源性清道夫

在生物體內有這樣的一類蛋白：OPP/OPNAs的磷/膦酰化修飾似乎并沒有對其造成明顯的不良影響，它依舊保持最初的生物學功能，參與機體正常的代謝過程。隨著蛋白的自身降解，有毒的OPP/OPNAs排出體外，這類蛋白包括BChE、白蛋白、轉鐵蛋白等，屬于內源性清道夫，通過與OPP/OPNAs共價結合來幫助機體清除毒物。對這些內源性清道夫的加合物進行研究，深入理解其加合位點、作用機制、周圍環境，對OP毒性的預防和抗OP毒性藥物的研發具有一定的啟示作用。

2.1 OPP/OPNAs與BChE的加合反應BChE主要分布于血清和肝臟中，肌肉和腦組織中也有少量存在[10]。因同屬于絲氨酸水解酶家族，BChE與AChE具有相似的結構特征：氨基酸序列的高度同源性、活性部位催化三聯體(Ser198-His438-Glu325)和外周陰離子部位、相似的三維結構、具有芳香氨基酸殘基。BChE催化水解丁酰膽堿(butyrylcholine，BCh)，其絲氨酸的羥基攻擊BCh的羰基碳，與丁酰基共價結合并釋放膽堿，隨后丁酰化酶水解釋放丁酸，BChE恢復活性。

OPP/OPNAs對BChE的抑制作用與AChE類似，即OP毒物的磷原子與Ser198的羥基共價結合生成OP-BChE加合物。不同的是，OP-BChE加合物僅起到中和毒物的作用，對機體沒有任何不良影響。研究表明，BChE與OP毒物的結合速率比AChE高，因血液中的高豐度、較長的半衰期、高反應性以及顯著的排毒功效，BChE被認為是最有效的生物清除劑，而人血漿中BChE的濃度約50nmol/L，不足以抵消高濃度的OPP/OPNAs。因此，OP毒性的防治常常采用外源性的BChE來實現[11]。此外，BChE也能催化水解ACh，但由于底物特異性和水解能力的差異性，反應進行緩慢。當AChE活性受到抑制時，BChE能代替AChE水解突觸后膜上過量的ACh或參與調節突觸前膜ACh的釋放過程。不足的是，這一過程只存在于周圍神經系統中，無法降低中樞神經系統中ACh的含量，故AChE被抑制時仍會出現膽堿能功能異常。

OPP/OPNAs進入生物體后，BChE的活性位點Ser198的羥基對OP毒物的磷原子進行親核攻擊，生成磷/膦酰化BChE。因此，可以通過鑒定體內的BChE加合物來判斷OP的暴露。染毒后的BChE經蛋白酶酶解獲得含有Ser198位點的肽段：胃蛋白酶酶解后的九肽加合物和胰蛋白酶酶解后的二十九肽加合物，兩種均可用于OP毒物的生物檢測，但相比于九肽加合物，二十九肽加合物因肽段分子量大，含有的氨基酸殘基多，觀察完整的y系列或b系列碎片離子以確定修飾位點的難度增加，所以修飾的FGESAGAAS肽段是檢測OP暴露的生物標志物[12]。然而，BChE加合物的檢測存在局限性：① OP-BChE加合物存在老化現象，且老化速度比AChE加合物快。老化后的BChE加合物缺少烷氧基的信息，無法對去烷基化后具有相同結構的OP毒物進行溯源。例如GB、GF、VX、VM和VR均含有甲基膦鍵，與被修飾的BChE生成老化的甲基膦酸標志物；VE的結構中含有乙基膦鍵，VE-BChE生成老化的乙基膦酸標志物；僅有甲基-、乙基-OPNAs類似物，如丙基沙林與BChE生成老化的丙基膦酸標志物。雖然甲基-、乙基-、丙基膦酸酯是OPNAs特有的，但仍無法對老化的OP毒物準確溯源；而對于常見的OPP，BChE加合物的OP毒性溯源似乎格外高效：O-甲醇酸酯和敵敵畏分別形成磷酸單甲氧基-、磷酸二甲氧基-BChE加合物；二嗪農生成二乙氧基硫代磷酸標志物，經硫醇-硫酮互變異構獲得的二嗪農異構體，與BChE共價結合生成一乙-、二乙氧基磷酸加合物。② 磷/膦酰化的BChE可經親核試劑(如肟)作用重新活化，加合物結構的破壞會影響對OP暴露的判斷，而肟無法恢復老化的BChE的活性，因此設計有效的烷基化劑是應對BChE加合物老化的重要途徑之一，但該領域的相關研究尚少[13]。

2.2 OPP/OPNAs與白蛋白的加合反應白蛋白是由肝實質細胞合成，在血漿中的半衰期約20 d，是血漿中含量最高的蛋白質，在維持膠體滲透壓、運輸營養和排除毒素等方面具有重要作用。1963年，桑格對標記肽進行氨基酸測序，證明二異丙氧基氟磷酸酯(diisopropoxy fluorophosphate，DFP)可以標記人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的酪氨酸殘基。此后，除絲氨酸水解酶之外，白蛋白逐漸成為探究OP毒物生物標志物的重要靶標。

相比于BChE加合物，OP-白蛋白加合物具有諸多優勢：①白蛋白的OP解毒作用強，同樣作為OP清道夫，血液中白蛋白的濃度是BChE的10000倍，彌補了反應速度慢的不足，可以通過與磷原子共價結合清除體內的OP毒物。②白蛋白的半衰期較長，意味著OP-白蛋白加合物在體內的保留時間比OP-BChE長，為OP暴露提供更好的檢測窗。③OP-白蛋白加合物更穩定，而OP-BChE易老化。BChE具有活性部位催化三聯體，其中絲氨酸殘基Ser198與OP上的磷原子共價結合，附近的組氨酸和谷氨酸會催化BChE加合物的老化過程，而白蛋白的活性部位不存在促進衰老的氨基酸殘基。④OP-白蛋白加合物的應用范圍廣。BChE加合物的研究沒有廣譜性，因為牛、山羊、綿羊的血液中沒有BChE，大鼠血液中的BChE含量低，而所有哺乳動物的血漿中都存在白蛋白，更具有研究價值。白蛋白與OPP/OPNAs發生親核反應，共鑒定出3種磷/膦酰化修飾的氨基酸殘基：酪氨酸殘基、賴氨酸殘基、絲氨酸殘基，它們的共性特征是具有親核側鏈，氨基酸殘基的ε側鏈進攻OPP/OPNAs上的磷原子形成OP-白蛋白加合物。OPP/OPNAs與不同的殘基的ε側鏈共價連接時，插入的位點也不同，例如GB的O-異丙基甲基磷酸酯分別被加到了酪氨酸的ε-酚羥基、賴氨酸ε-氨基、絲氨酸的ε-羥基上[13-14]。

2.2.1OP-酪氨酸加合物 酪氨酸殘基可以被多種OP毒物磷/膦酰化修飾，如DFP與菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋清溶菌酶上的酪氨酸殘基共價結合；OPP(對硫磷、敵敵畏、毒死婢、馬拉硫磷、丙胺磷、DFP)、OPNAs(GB、GD)與HSA、純小鼠白蛋白的酪氨酸(tyrosine，Tyr)411殘基共價連接。FP-生物素對牛血清白蛋白磷酰化修飾的活性位點Tyr410，相當于HSA的Tyr411。對特殊標記的Tyr411深入研究，發現其pKa值(7.9-8.3)明顯低于酪氨酸殘基的平均水平(pKa=10)，解析加合物的晶體結構時發現，該殘基與多個帶正電的基團相鄰并處于非極性環境中，Tyr411的羥基臨近Arg410和Lys414的側鏈。將Tyr411定點突變為Ala時，白蛋白的活性消失，而將Arg410突變為Ala時，白蛋白的活性大大降低，說明Tyr411是HSA的活性位點，Arg410對穩定其高反應性具有重要作用。據悉，Tyr411是最具高反應性的殘基，分析蛋白加合物進行OP溯源時，OP毒物中不同的離去基團會影響OP檢測限，例如對硫磷、毒死婢很容易確定到1 μmol·L-1的暴露水平，丙胺磷在高水平(1 mmol·L-1)下可以檢測樣本，但預估能夠達到1 μmol·L-1的檢測水平，而馬拉硫磷的檢測限為1 mmol·L-1，提示相比于其余3種OPP的酚羥基離去基團，馬拉硫磷的硫醇基團與Tyr411有較低的反應性。除Tyr411外，HSA中的Y263也具有高反應性，能夠同時被6種OPNAs(GA、GB、GD、GF、VX及其異構體)共價修飾。對Y263的空間結構及電子效應進行研究，發現Y263較大的溶劑可及性(%SAS)，增加了與OPNAs發生碰撞的機會，離子對(與距離4.21 ?的K233形成的離子對)和非共價相互作用(酚羥基與距離2.89 ?的E230形成氫鍵)在穩定加合物中具有關鍵作用。HSA上有關活性位點Tyr411和Y263的研究啟示：OPP/OPNAs與殘基的共價結合與OP毒物的離去基團、活性位點的結構和周圍環境有關[15]。此外，殘基離子化也會影響加合反應，FP-生物素在pH 8.0～8.3下高劑量染毒HSA并延長染毒時間，發現90%結合在Tyr411，其余10%標記在其它殘基上，如絲氨酸，研究其特殊反應性，發現酪氨酸羥基的pKa低于絲氨酸羥基(pKa：10.1<16)，同時，由于周邊的精氨酸或賴氨酸對酪氨酸或絲氨酸的離子化羥基的穩定作用，導致離子化的酪氨酸比例遠高于絲氨酸，使酪氨酸更容易發生加合反應且加合比例更大。

2.2.2OP-賴氨酸加合物 OPP/OPNAs對賴氨酸殘基的磷/膦酰化修飾是基于賴氨酸的ε-氨基對OP毒物上磷原子進行親核攻擊，然后在ε-氨基上加一個有機磷部分，例如毒死婢和DFP與HSA發生親核反應，分別得到二乙氧基-和二異丙氧基-磷酰化賴氨酸[16]。GA對體外(牛、卵磷脂、大鼠、兔)純白蛋白和體內(卵磷脂、大鼠、兔)白蛋白的膦酰化修飾，發現體內外有相似的被修飾的肽序列，且在不同物種中均保持穩定。GA-卵磷脂加合物的形成是源于賴氨酸側鏈的氮原子對GA上磷原子的親核攻擊，膦酰化的殘基通常存在于白蛋白的表面或附近的空腔內，具有較低的PKa值和CDOCKER相互作用能。CDOCKER相互作用能越低表示加合物越穩定，如體內的活性位點K414與GA之間的加合物具有較強的結合能(-24.3242 kcal/mol)，穩定性較強，而未標記的賴氨酸殘基的CDOCKER相互作用能較高[17]。此外，膦酰化的賴氨酸殘基的反應性同樣受到氫鍵、靜電作用、電子對的影響，如GA靠近HSA上的K525時，氮原子與K525和Y401的側鏈形成氫鍵，碳原子與F551的側鏈形成H-π共軛，這兩個因素有助于增強GA-K525的疏水性，降低親水性和GA與K525親核反應能，使加合物更加穩定[9]。提示可以通過誘變或化學修飾鄰位殘基來改變周圍環境，降低氨基酸殘基的pKa，從而增加OP與白蛋白的反應性。不同物種的氨基酸序列顯示兔血清白蛋白(rabbit serum albumin，RSA)與HSA的序列同源性高達76.03%，高于常用的實驗動物大小鼠。GD對RSA、兔血漿染毒發現存在GD-賴氨酸加合物，而兔體內膦酰化的殘基僅發現賴氨酸，因體內GD的暴露劑量遠低于體外，在未使用過量毒物的情況下，賴氨酸殘基優先被標記，推斷RSA體內賴氨酸殘基比酪氨酸、絲氨酸的反應性更高，可能的原因有：①賴氨酸是堿性氨基酸，其側鏈易解離并帶有正電荷，增強了親核活性；②賴氨酸ε-氨基優先與GD形成加合物，而非酪氨酸的ε-酚羥基、絲氨酸的ε-羥基，可能是其官能團賦予其這種特性[7]。

2.2.3OP-其他氨基酸加合物 在沒有活性位點絲氨酸的蛋白中，酪氨酸和賴氨酸的反應性比絲氨酸大。當實驗條件加大，如增加OP毒物濃度、延長染毒時間等，就會出現OPP/OPNAs與絲氨酸殘基的加合現象，但絲氨酸加合物的穩定性遠低于酪氨酸加合物，同樣在pH8.3的條件下溫育，一個月后仍能觀察到被OP修飾的酪氨酸，而OP-絲氨酸加合物早已不見蹤影，這可能由于：①OP-絲氨酸容易進行β消除以釋放有機磷部分，只剩下脫氫丙氨酸，而OP-酪氨酸并未發現釋放有機磷酰基部分的證據。②OP-絲氨酸可以輕松去除有機磷部分，導致肽的質譜圖中沒有特征性片段，而OP-酪氨酸相對穩定的產生大量的特征性片段，為OP標記的酪氨酸的存在提供證據[18]。膦酰化的絲氨酸位點同樣有其結合特征，HSA上的K*VPQVSTPTLVEVSR肽段上的S419與結構相似的GB和GF有較強的親和力，其中GB的磷原子與HSA中S419側鏈的氧原子形成共價鍵，同時，GB與HSA中K500側鏈的氮原子之間的氫鍵、與相鄰殘基之間較低的非共價結合能，均增加了GB-HSA的穩定性。具有硫醇離去基團的OP毒物，如V類OPNAs(VX、VR、Vs)和OPP(氧化氫-甲基、樂果、氧化樂果)能與HSA中唯一的非二硫鍵橋接的半胱氨酸殘基(Cys34)形成二硫加合物，它是通過游離的硫醇離去基團或二硫鍵二聚體與Cys34之間進行硫醇-二硫鍵交換形成的。以VX為例，VX的含硫離去基團2-(二異丙基氨基)乙硫醇(2-(diisopropylamino)ethanethiol，DPAEP)與Cys34形成二硫加合物，酶解后會以半胱氨酸-脯氨酸二肽或三肽的形式釋放。這些毒物與白蛋白會形成兩個中心的加合物，一個是含硫中心的二硫加合物，一個是含磷中心的磷/膦酰化加合物，其中二硫加合物的靶向氨基酸為半胱氨酸，而磷/膦酰化加合物的靶標主要為酪氨酸或賴氨酸。有一種觀點：磷/膦酰化的酪氨酸鄰近Cys34時有助于二硫加合物的形成。但在HSA的三維結構中，沒有一個反應性的酪氨酸(包括高反應性的Tyr411)與Cys34接近，僅有Tyr84、Tyr140在Cys34附近，提示這兩種酪氨酸可能是OP毒物的潛在靶點。

2.3 OPP/OPNAs與轉鐵蛋白的加合反應轉鐵蛋白(transferrin，TRF)由肝細胞合成，是血漿中主要的含鐵蛋白，負責運輸由消化管吸收的鐵和由紅細胞降解釋放的鐵。盡管轉鐵蛋白的半衰期僅有7 d，但因其胰蛋白酶酶解樣本在40℃的環境中可以保存一個月以上，同樣能作為檢測OP加合物的良好靶標蛋白[19]。采用過量的OP毒物(GB、GA、VX、GD、GF、乙基塔崩、丙基塔崩)轉染人轉鐵蛋白，結合位點涉及3種類型的殘基：酪氨酸-、賴氨酸-和絲氨酸殘基，其中Y515位點同時被GB、GD、VX標記，是轉鐵蛋白中最具反應性的殘基，處于暴露狀態并與其他殘基之間存在氫鍵相互作用。同時，發現OP與酪氨酸的結合似乎更傾向于附近有帶正電的精氨酸或賴氨酸，結合白蛋白中的標記肽進行研究：在pH=8.3的條件下，采用0.1、0.2 mmol·L-1的DFP、毒死婢和敵敵畏染毒兩條合成肽段ArgTyrThrArg和SerTyrSerMet，在ArgTyrThrArg肽段上發現酪氨酸加合物，而另一條肽段上沒有發現毒物標記，將染毒濃度增加至1 mmol·L-1，質譜中發現較弱的離子化肽，發現規律：位于帶正電荷的精氨酸或賴氨酸殘基附近的酪氨酸殘基通常具有高反應性。當轉鐵蛋白上的酪氨酸或賴氨酸被膦酰化后仍能與三價鐵離子結合并發生氧化還原反應，表明轉鐵蛋白的生理功能不受加合物的影響。

3 低劑量毒性的相關蛋白

AChE的快速磷/膦酰化充分解釋了OPP/OPNAs的急性毒性作用。然而，當確認低劑量的OP毒物在未抑制AChE的情況下仍能產生神經毒性，如頭痛，記憶力減退，學習能力差，睡眠困難，疲勞和肌肉無力時，提示有除抑制ChE之外的機制參與其中，而磷/膦酰化修飾的白蛋白或轉鐵蛋白并不能解釋低劑量毒性的由來，說明另有靶標經OPP/OPNAs修飾后對生物體的神經功能造成損傷。但該領域進展緩慢，目前尚不明確其發生機制。

3.1 OPP/OPNAs與細胞骨架蛋白的加合反應據悉，低劑量的OP毒物干擾神經發育的過程，如神經元增殖、分化、凋亡、軸突發生、突觸形成，甚至神經膠質細胞的增殖、分化等。神經元細胞骨架是由微管、微絲、中間絲構成的蛋白纖維網架體系，在正常的神經發育中至關重要，其骨架蛋白有望成為研究OP神經毒性的重要靶標[20]。

3.1.1OPP/OPNAs與微管蛋白的加合反應 微管蛋白是微管的主要成分，包括3種：α-、β-、γ-微管蛋白，前兩種微管蛋白占總量的80%～95%，具有相似的三維結構，能夠緊密結合形成二聚體并參與微管的組裝；γ-微管蛋白位于微管組織中心，對微管的形成、數量、位置及細胞分裂具有重要作用。微管蛋白聚合形成微管，參與營養物質從神經細胞體到神經突觸的運輸。有報道稱，易感動物體在OP暴露后引起的OPIDN、認知功能缺陷或與微管蛋白功能損壞、軸突運輸中斷有關[21]。在FP-生物素染毒的活體小鼠的腦內上清液中發現被標記的分子量為55KDa的蛋白，質譜鑒定該蛋白的主要成分為微管蛋白。隨后研究發現，OPP(毒死婢、DFP、FP-生物素)和OPNAs(GB、GD)能與牛微管蛋白(α-、β-微管蛋白)上的酪氨酸殘基和賴氨酸殘基共價結合，其中α-微管蛋白上的Tyr83和β-微管蛋白上的Tyr281暴露在微管蛋白二聚體的表面，與三磷酸鳥苷分子的鳥嘌呤部分具有π-π相互作用，二者的OP反應性最高，且反應速度也比其他氨基酸殘基快。同時，被標記的微管蛋白聚合會形成異常短的微管，微管結構改變，運輸功能異常導致神經傳遞和信號轉導功能受損[22]。

3.1.2OPP/OPNAs與角蛋白的加合反應 皮膚是OP毒物進入生物體的重要途徑。研究表明，暴露于14C-VX環境中的家豬，皮膚內會殘留約20%的放射性，明確了皮膚在OP暴露中的研究價值，而VX對人類皮膚的滲透性不及豬皮，會在更大面積的皮膚上擴散，因此使用劑量的大部分會保留在施用部位的皮膚內。FP-生物素與人角蛋白的加合物肽段THEN*FESFNNLR上的酪氨酸殘基Tyr230共價結合，肯定了皮膚內蛋白加合物對檢測OP暴露、對OP歸因的可行性。皮膚中的角蛋白是中間絲的重要組成部分，主要存在于所有上皮細胞和部分非上皮細胞，用于維持細胞的形狀和抵抗外界的壓力。OPNAs(VX、DFP)和OPP(毒死婢、FP-生物素)與人足底的愈傷組織內的角蛋白形成蛋白加合物，涉及酪氨酸殘基、絲氨酸殘基，而在毒死婢與角蛋白加合物的胰蛋白酶解片段中僅發現了被共價修飾的酪氨酸殘基，提示與酪氨酸相比，絲氨酸殘基對OP毒物的反應性較低[23-24]。關于角蛋白的研究尚少，或許角蛋白的其他位點也被修飾，但因消化肽的含量太低、檢測水平有限而未發現。

3.1.3OPP/OPNAs與其他骨架蛋白的加合反應 除微管蛋白、角蛋白外，微絲的主要構成蛋白——肌動蛋白加合物也被發現，FP-生物素能夠標記牛肌動蛋白上的酪氨酸殘基(Tyr55、Tyr200)。據報道，大鼠重復暴露于閾值以下劑量的毒死婢或DFP中，其坐骨神經中的順行性軸突運輸受損。除微管蛋白外，與之相關的tau蛋白、驅動蛋白分別參與軸突內微管的組裝和穩定、外周和中樞神經系統中軸突運輸，同樣具有研究價值，例如DFP處理的母雞中tau蛋白磷酸化；對氧磷、毒死婢會直接影響驅動蛋白，破壞微管內依賴驅動蛋白的運輸。

3.2 OPP/OPNAs與神經病靶標酯酶的加合反應神經病靶標酯酶(neuropathy target esterase，NTE)是一種只催化經CDP-膽堿途徑合成卵磷脂的磷脂酶B，表達主要受卵磷脂、環腺苷酸、泛素-蛋白酶體途徑的調節，主要存在于哺乳動物神經細胞和非神經細胞中的內質網膜上[25-27]。據報道，OPIDN是由OP毒物對NTE的磷/膦酰化引起的。NTE屬于絲氨酸酯酶，與絲氨酸水解酶(AChE、BChE)的反應機理相似，是OPs上的磷原子與NTE的活性位點絲氨酸Ser966共價結合抑制NTE的酶活性，隨后磷/膦酰化的NTE發生老化：NTE上的OP部分的側鏈斷開，或OP基團的去質子反應，只留下一個帶負電的取代基結合到酶的活性位點上，NTE的活性被永久抑制。在神經元中，NTE的活性被抑制會破壞內質網膜脂穩態，而神經軸突內營養物質的運輸都是靠內質網完成的，這一過程會不可避免的遭受擾亂。在神經膠質細胞中，NTE的抑制也會影響膜磷脂代謝，破壞神經元和神經膠質細胞之間正常的相互作用。正常情況下，神經元被一層神經膠質膜緊密包被時，神經元會向其下游神經膠質細胞發出停止包被的信號，而NTE抑制后，中斷二者之間的相互作用，神經元會被多層神經膠質膜松散的包被，繼而導致兩種細胞凋亡，遠端軸突發生退變。此外，NTE有溶血磷脂酶的活性，對磷脂代謝具有重要作用。當酶抑制，脊髓等部位的磷脂代謝和信號通路中斷，可能會造成遲發性毒性的發生。總之，OPs引起的NTE活性抑制會誘發以外周神經變性為主要特征的OPIDN，期間NTE的生物功能喪失，神經毒性作用產生。

3.3 OPP/OPNAs與泛素的加合反應泛素(ubiquitin，Ub)是所有真核細胞中的一種小蛋白，游離存在于細胞內或共價綴合到各種胞質、核和整合的膜蛋白上，通過單泛素化或多泛素化底物蛋白參與細胞中的多種代謝過程，如細胞周期調控、信號轉導功能、應急反應、DNA損傷修復等。Ub的氨基酸序列中包含賴氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸殘基，是典型的磷酸化位點。然而，與V類毒劑一同孵育時，發現僅在賴氨酸殘基上形成蛋白加合物。正常PH條件下，暴露于蛋白表面的賴氨酸殘基側鏈上的氮原子會發生質子化，無法再與親核試劑發生反應。而膦酰化的賴氨酸殘基附近存在酸性基團谷氨酸，可以臨時接受其質子，促進加合物的生成[28]。事實上，暴露于蛋白表面的7個賴氨酸殘基中，至少有6個對Ub的生物學功能至關重要，這取決于賴氨酸殘基中游離的ε-氨基，它能與Ub分子中游離的C端G76殘基反應，形成多聚泛素鏈，而被修飾的賴氨酸殘基會失去其生物學功能[29-30]。簡言之，OPs與賴氨酸殘基的加合作用會破壞Ub正常的生理功能，進而產生毒性作用。

4 小結

通過深度探究OP毒物與蛋白質之間的加合反應機制，了解活性位點的結構特征，為之后的OP毒物的確認暴露、溯源歸因、精準治療、合理預防提供了新思路：(1)通過鑒定蛋白加合物的存在來實現OP的確認暴露，與OP毒物原型、代謝產物相比，生物體內的蛋白加合物為OP的暴露提供了更好的檢測窗。對OP毒物的檢測時間無需再限定于48 h之內，研究者可以根據蛋白加合物在生物體內的保留時間來選擇通過測定哪種蛋白加合物來判斷OP暴露；(2)通過分析蛋白加合物中與活性位點相結合的OP毒物的保留基團對OP毒性進行溯源歸因，為OP中毒提供更多有效信息，幫助醫生對OP中毒患者實現精準治療。目前，以蛋白加合物為基石對OP毒性溯源的文章較少，難以形成歸因溯源的完整體系，提示可以總結常見的物種體內不同蛋白加合物對OPP/OPNAs的溯源情況，互為補充，進而形成一張比較完善的溯源譜圖以供醫療參考；(3)充分掌握蛋白加合物的形成規律、活性位點的結構特征。蛋白加合物形成的影響因素較多，與結合蛋白的種類、結構，活性位點暴露情況、周圍環境(如空間結構、電子效應、靜電作用(氫鍵、共軛鍵))，氨基酸殘基的酸堿性、解離情況、帶電情況等因素相關，通常處于暴露狀態(具有較大的%SAS)、與鄰位殘基形成離子對或存在非共價相互作用、pKa值較小、周邊有帶正電的氨基酸殘基的活性位點，易于與OP毒物共價結合形成蛋白加合物。該規律可用于新藥研發，作為預防藥，通過預先與活性位點相結合來阻止有毒蛋白加合物的生成；或作為治療藥，通過改變加合物的結構、加合位點的結構特征，破壞已生成的有毒蛋白加合物以達到解毒目的。