Exendin-4通過調控SIRT1/P53信號通路改善高糖作用下的內皮祖細胞功能障礙

趙 祺，涂 強，謝華強，曹 政,2

(1. 十堰市太和醫院，2. 湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000)

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)來源于造血干細胞，在血管內皮損傷修復及出生后血管生成中扮演著重要的角色。研究表明,EPCs的循環數量可以作為心血管患者預后的預測因素，冠心病和(或)糖尿病患者EPCs數量及功能明顯受損，因此，積極尋求改善EPCs數量及功能的有效手段是目前臨床亟待解決的問題[1-2]。Exendin-4是胰高糖素樣(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動劑，其商品名為艾塞那肽，目前廣泛用于2型糖尿病的臨床治療。大量研究證實，GLP-1受體激動劑除了具有降血糖作用外，還可明顯降低心血管不良事件的發生率，其保護效應與抗炎、抑制氧化應激、改善內皮功能等有關。但Exendin-4對高糖作用下EPCs是否具有有益效用尚不清楚，本研究旨在觀察Exendin-4對高糖作用下EPCs功能活性的的影響，并探討Exendin-4改善高糖作用下EPCs功能活性的可能機制。

1 材料與儀器

外周血單核細胞分離液及人纖維連接蛋白均購自美國Sigma公司；內皮細胞專用培養基(EGM-2)購自美國PromoCell公司；逆轉錄PCR試劑盒購自TaKaRa公司；Exendin-4(批號：HY-13443)、EX-527(批號：HY-15452)及SRT1720(批號：HY-10532)均為美國MedChemExpress公司產；甘露醇(批號：IM0040)及D-葡萄糖(批號：G8150)購自索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及β-actin抗體均購自碧云天公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒及丙二醛(MDA)測定試劑盒產自南京建成生物工程研究所；SIRT1抗體、p53抗體、乙酰化p53抗體購自美國CST公司;其它試劑均為進口分裝或國產分析純。高速大容量離心機購自德國Eppendorf公司；二氧化碳培養箱購自美國Thermo Scientific公司；實時熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司；多功能酶標儀購自美國BIOTEK公司；MiniProGelTM蛋白制膠、電泳與轉膜套件及超高靈敏度化學發光儀均購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 晚期EPCs分離及培養獲取健康志愿者外周靜脈血約30 mL，采用外周血單核細胞分離液純化出血單個核細胞后重懸于EGM-2培養基(含配套生長因子)，接種于預先包被好纖維連接蛋白(5 mg·L-1)的6孔板中，每3 d換液，培養至28 d左右的貼壁細胞即為實驗所用的晚期EPCs。本實驗經十堰市太和醫院倫理委員會批準，所有志愿者均簽署知情同意書。

2.2 實驗分組將晚期EPCs置于5% CO2，37 ℃培養箱中，采用5%胎牛血清的EGM-2培養基培養，0.25%胰酶消化傳代。用高糖培養基聯合不同濃度Exendin-4(12.5、50、100、200 μmol·L-1)孵育EPCs 72 h，確定Exendin-4的最適濃度。在篩選出最為合適的Exendin-4濃度后，進一步將其隨機分為甘露醇對照組(加入甘露醇維持和高糖組相同的滲透壓)、高糖組(葡萄糖含量為25 mmol·L-1)、高糖+Exendin-4組、高糖+EX-527組、高糖+Exendin-4+EX-527和高糖+SRT1720組。各組細胞在處理72 h后進行相關指標檢測。

2.3 EPCs活力檢測將晚期EPCs消化重懸后接種于96孔板中(1×103個細胞/孔)，在EGM-2培養基中加入或不加入Exindin-4(12.5、50、100、200 μmol·L-1)并聯合高糖(25 mmol·L-1)培養,甘露醇對照組在正常培養基基礎上加入甘露醇。各組細胞在處理72 h后按照說明書加入CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育3 h。用酶標儀在450 nm處檢測各孔的吸光度，根據OD值計算細胞活力大小。

2.4 EPCs遷移能力檢測各組細胞在處理72 h后檢測EPCs遷移能力。將各組EPCs消化后重懸，按2×104個EPCs加入Boyden小室上室，在下室中加入700 μL EGM-2培養基，細胞培養8 h后取出Boyden小室，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色10 min后用棉簽小心擦掉小室濾膜孔上表面上未遷移的細胞并于倒置顯微鏡下計數。

2.5 EPCs黏附能力檢測各組細胞在處理72 h后檢測EPCs黏附能力。將各組EPCs消化、重懸，按1×105/孔接種到預先包被有人纖維連接蛋白的6孔板中，細胞培養3 h后棄去未貼壁細胞，PBS清洗2次，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色10 min后于倒置顯微鏡下拍照并計算黏附細胞個數。

2.6 EPCs小管形成實驗各組細胞在處理72 h后檢測EPCs小管形成能力。將Matrigel放入4 ℃融化，待Matrigel完全融化后，冰上操作，在24孔板底部各加入100 μL基質膠，在37 ℃放置2 h使Matrigel完全凝固。將各組細胞消化重懸并計數，按每孔1×105個細胞接種于24孔培養板中，培養8 h后，使用倒置顯微鏡拍照記錄EPCs小管形成能力，并使用ImageJ軟件對管腔形成情況進行分析。

2.7 乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平檢測各組細胞在處理72 h后采用RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min后取上清。同時按照LDH和MDA檢測試劑盒進行檢測，按照廠家說明書建立標準曲線，于酶標儀下分別檢測各組樣品的OD值，并根據OD值計算出LDH和MDA的活性。

2.8 實時熒光定量PCR檢測TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達各組細胞在處理72 h后檢測EPCs中TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表達。使用Trizol試劑提取細胞中總RNA，測定總RNA濃度，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄獲得cDNA。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。TNF-α的上游引物序列為5′-TGGGATCATTGCCCTGTGAG-3′，下游引物序列為5′-GGTGTCTGAAGGAGGGGGTA-3′;IL-1β的上游引物序列為5′-GGCTGCTCTGGGATTCTCTT-3′，下游引物序列為5′-ATTTCACTGGCGAGCTCAGG-3′，IL-6的上游引物序列為5′-TTTTGGTGTTGTGCAAGGGTC-3′，下游引物序列為5′-ATCGCTCCCTCTCCCTGTAA-3′;內參照β-actin的上游引物序列為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物序列5′-CTCCAATGTCACGCACGAT-3′。置于實時熒光定量PCR儀中進行擴增，采用2-ΔΔCT法計算各組細胞中mRNA的相對表達量。

2.9 Western blot檢測EPCs中SIRT1、p53和Ac-p53蛋白表達各組細胞在處理72 h后采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE電泳，并轉印SIRT1、p53、Ac-p53蛋白至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h，用相應的特異性一抗4 ℃孵育過夜，再經洗膜，然后孵育相應二抗室溫2 h后再次洗膜，最后采用ECL化學發光法顯影，經ImageJ軟件進行吸光度測定，并與內參β-actin吸光度相比較得到各組蛋白條帶相對值。

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 Exendin-4改善高糖作用下EPCs活力為探討Exendin-4對高糖作用下EPCs活力的影響,本研究將晚期EPCs與含或不Exendin-4(12.5、50、100、200 μmol·L-1)的高糖培養基在37 ℃下培養72 h后檢測其細胞活力并篩選最為合適的藥物作用濃度。CCK-8實驗結果顯示，Exendin-4以劑量依賴性改善高糖作用下EPCs細胞活性，其中Exendin-4以50 μmol·L-1的濃度作用最為明顯(Fig 1，P<0.05)，故后續實驗采用50 μmol·L-1的Exendin-4進行干預。

Fig 1 Effects of Exendin-4 on viability of EPCs with high glucose treatment n=5)

3.2 Exendin-4改善高糖作用下EPCs遷移能力采用Transwell小室法探討50 μmol·L-1的Exendin-4處理對高糖作用下EPCs體外遷移能力的影響。結果顯示：高糖處理可顯著下調EPCs體外遷移能力(Fig 2，P<0.05)，Exendin-4處理可提高高糖作用下EPCs體外遷移能力(Fig 2，P<0.05)。為進一步評估Exendin-4的作用是否依賴于SIRT1/P53信號通路，我們使用SIRT1抑制劑(EX-527)和SIRT1激動劑(SRT1720)聯合處理EPCs 72 h。結果顯示SIRT1抑制劑(EX-527)干預后能夠抑制Exendin-4增強EPCs遷移能力的效應(Fig 2，P<0.05),單獨使用SIRT1激動劑(SRT1720)也可改善高糖作用下的EPCs遷移能力(Fig 2，P<0.05)。

Fig 2 Representative photographs and quantification analysis of migratory activity of EPCs

A：Control; B：HG；C:HG+EX-4; D:HG+EX-527; E:HG+EX-4+EX-527; F：HG+SRT1720.*P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs HG group.

3.3 Exendin-4改善高糖作用下EPCs黏附能力與甘露醇對照組相比，高糖處理組EPCs黏附能力明顯下降(Fig 3，P<0.05)；與高糖處理組相比，Exendin-4組EPCs體外黏附能力明顯提高(Fig 3，P<0.05)。而SIRT1抑制劑(EX-527)干預后能夠抑制Exendin-4增強EPCs黏附能力的效應(Fig 3，P<0.05), 單獨使用SIRT1激動劑(SRT1720)也可改善高糖作用下的EPCs黏附能力(Fig 3，P<0.05)。

Fig 3 Representative photographs and quantification analysis of adhesion of EPCs n=3)

3.4 Exendin-4改善高糖作用下EPCs小管形成能力體外小管形成實驗顯示，高糖處理可明顯降低EPCs小管形成能力(Fig 4，P<0.05)；Exendin-4處理則可改善高糖作用下的EPCs體外小管形成障礙(Fig 4，P<0.05)，說明Exendin-4具有促進EPCs在Matrigel 上形成小管的作用。SIRT1抑制劑(EX-527)干預后能夠抑制Exendin-4對EPCs的促血管形成效應(Fig 4，P<0.05)，單獨使用SIRT1激動劑(SRT1720)也可改善高糖作用下的EPCs小管形成能力(Fig 4，P<0.05)。

Fig 4 Representative photographs and quantification analysis of tube formation of EPCs n=3)

3.5 Exendin-4改善高糖作用下EPCs乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平與甘露醇對照組相比，高糖處理組EPCs LDH及MDA水平明顯升高(Fig 5，P<0.05)。與高糖處理組EPCs相比，Exendin-4組LDH及MDA水平明顯改善(Fig 5，P<0.05)。SIRT1抑制劑(EX-527)干預后能夠抑制Exendin-4對EPCs的保護效應(Fig 5，P<0.05),單獨使用SIRT1激動劑(SRT1720)也可改善高糖作用下的EPCs LDH及MDA的產生(Fig 5，P<0.05)。

Fig 5 Effects of Exendin-4 on level of LDH and MDA with high glucose treatment n=3)

3.6 Exendin-4抑制高糖作用下EPCs炎癥因子產生RT-qPCR顯示，高糖處理可明顯上調EPCs TNF-α、IL-β及IL-6的mRNA表達(Fig 6，P<0.05)。與高糖處理組EPCs相比，Exendin-4組EPCs TNF-α、IL-β及IL-6的mRNA表達水平明顯下調(Fig 6，P<0.05)。說明Exendin-4具有抑制高糖作用下細胞炎癥因子表達的作用。而SIRT1抑制劑(EX-527)干預后，Exendin-4的抗炎效應被抑制(Fig 6，P<0.05)。單獨使用SIRT1激動劑(SRT1720)也可改善高糖作用下的EPC TNF-a，IL-β及IL-6的mRNA表達(Fig 6，P<0.05)。

Fig 6 Effects of Exendin-4 on mRNA level of TNF-α、IL-1β and IL-6 with high glucose treatment n=3)

3.7 Exendin-4通過SIRT1/p53信號通路調控高糖作用下EPCs功能活性Western blot結果分析顯示，高糖處理可明顯下調EPCs SIRT1表達并增加p53乙酰化水平(Fig 7，P<0.05)。Exendin-4處理可顯著上調高糖處理組EPCs SIRT1表達并降低p53乙酰化水平(Fig 7，P<0.05)。如Fig 7所示，SIRT1抑制劑可處理可顯著逆轉Exendin-4的SIRT1激活效應(Fig 7，P<0.05)。這些結果提示，Exendin-4主要通過SIRT1/p53信號通路調控高糖作用下EPCs功能活性。

Fig 7 Effects of Exendin-4 on protein expression of SIRT1 and P53 with high glucose treatment n=3)

4 討論

Asahara等[5]于1997年首次從成人外周血中分離出一類具有促進血管內皮修復及新生血管形成效應的內皮細胞前體細胞，后被命名為“內皮祖細胞”。目前，根據其表面標志物的不同，可以分為早期EPCs和晚期EPCs：早期EPCs增殖能力低下，主要通過旁分泌作用促進周圍血管內皮細胞修復；晚期EPCs增殖能力旺盛，可進一步分化為成熟內皮細胞并促進新生血管形成[6-7]。作為種子細胞，EPCs在冠心病、糖尿病等缺血性疾病的治療中具有極大的潛力。既往研究顯示，EPCs在體外經過高糖處理后，遷移能力和管型形成能力受損[8-9]。糖尿病患者循環血中早期及晚期EPCs的數量均較正常人下降，其增殖、遷移、黏附和管型形成能力減弱，即使血糖糾正后EPCs功能異常仍不能完全恢復[10-11]。因此積極尋求改善糖尿病EPCs功能活性，是防治糖尿病心腦血管并發癥的干預手段之一。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是腸道L細胞分泌的一種多功能激素，除了控制血糖、抑制胃排空、降低食欲，還表現出對心血管疾病的保護作用。天然GLP-1半衰期極短，在血液中很快被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl-peptidase，DPP-4) 降解失活而使臨床使用受限。Exendin-4是GLP-1受體激動劑，具有較長的半衰期，與GLP-1受體結合后產生與GLP-1相似的生理效應。國外已有相關研究報道Exendin-4能夠改善糖尿病動物心肌的氧化應激、脂質代謝，逆轉心臟重塑，但具體機制仍未完全闡明[12]。

沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)為依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白脫乙酰酶，主要參與調節DNA損傷修復、肌肉和脂肪分化、神經發生、線粒體穩態、葡萄糖和胰島素代謝以及細胞應激等，在生物代謝、發育、細胞存活和衰老中起重要作用[13-14]。近來研究表明，SIRT1通過調控下游轉錄分子，具有多重心血管保護作用。研究證實，在糖尿病小鼠模型中上調SIRT1表達可減輕氧化應激、抑制炎癥反應并明顯改善小鼠受損的內皮功能[15]。此外，研究發現野生型糖尿病小鼠的主動脈中超氧化物歧化酶(MnSOD)顯著下調，而內皮特異性SIRT1轉基因小鼠成功逆轉了MnSOD的下降，從而提示SIRT1/MnSOD途徑在抑制高血糖引起的內皮功能異常中起著關鍵作用[16]。本研究證實：高糖處理可顯著抑制晚期EPCs增殖、遷移、黏附、小管形成能力，同時導致細胞乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平升高，上調炎癥因子表達，其機制與高糖誘導的SIRT1表達下調有關。Exendin-4可上調SIRT1表達，降低p53乙酰化水平，進而改善高糖的誘導的EPCs功能障礙，但其保護效應可被SIRT1抑制劑所削弱。同時SIRT1激動劑亦可模擬Exendin-4的保護效應，由此說明Exendin-4的有益效應是通過調控SIRT1/p53信號通路介導的。

綜上所述，本研究通過體外構建高糖誘導的EPCs損傷模型，探討了Exendin-4對高糖作用下EPCs功能活性的影響以及其可能機制。研究初步發現高糖可下調SIRT1表達導致EPCs功能障礙；Exendin-4可通過上調SIRT1表達，改善高糖誘導的EPCs功能障礙。本研究揭示了Exendin-4對高糖作用下EPCs的保護效應，以及SIRT1蛋白在其中所發揮的作用，為利用EPCs開展疾病治療提供了實驗依據。