高血壓循環(huán)外泌體中關鍵miRNA的篩選及功能研究

張波濤，袁 雯，劉曉艷，鐘久昌，陳牧雷，王紅石，王華光，池洪杰

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院,北京市高血壓重點實驗室，北京 100020)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見的慢性病，也是重要的心腦血管疾病的危險因素。中國高血壓調查最新數(shù)據顯示，2012～2015年我國18歲及以上居民高血壓患病粗率為27.9%(標化率23.2%)，且患病率總體呈增高的趨勢[1]。然而，由于對其機制認識不足，高血壓治療領域進展緩慢。如何預防和減少高血壓病的發(fā)生，以及如何有效的控制已發(fā)生的高血壓依然是世界性難題。

外泌體(exosome，exo)是最小的細胞外囊泡，由胞內多囊泡小體(multive bodies，MVB)與胞膜融合后分泌到細胞外環(huán)境中。外泌體直徑為30～100 nm，能通過與靶細胞的細胞膜融合、胞吞等作用方式將攜帶的微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、蛋白質等傳遞至受體細胞中，介導細胞間的信息交流并調控細胞的生理功能[2]。

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，是外泌體的重要信息物質。外泌體攜帶的miRNA參與了多種疾病的發(fā)病過程。在心血管疾病領域，外泌體miRNA是急性心肌梗死的生物標志物和心衰的潛在預測因子，參與了心肌病的發(fā)病、在動脈粥樣硬化中具有多方面的作用[3]。

外泌體與高血壓的研究多集中在尿液外泌體中蛋白和miRNA的檢測。部分研究提示，血液源外泌體可能在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。血液源外泌體中哪種信息物質影響高血壓的發(fā)生發(fā)展，外泌體miRNA是否參與高血壓的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。

為此，本研究提取自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)血漿外泌體，尾靜脈注射的方法注射入血壓正常(Sprague Dawley，SD)大鼠體內，觀察大鼠血壓的變化；提取高血壓患者及SHR大鼠的血漿外泌體及外泌體RNA，應用實時聚合酶鏈反應(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法驗證本課題組前期篩選出的8個miRNAs的表達變化；Western blot的方法檢測人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)中轉染miR-17-5p mimics后肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)及同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)蛋白水平的表達變化，探討外泌體參與高血壓發(fā)生的可能機制，為進一步研究外泌體在高血壓的發(fā)生發(fā)展中的作用提供前期基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1研究人群 收集北京朝陽醫(yī)院2019年2月至2019年7月間門診就診的原發(fā)性高血壓患者20例(高血壓組)，女性10例，男性10例，平均年齡(43.65±7.99)歲，年齡及性別匹配的健康對照組20例，女性8例，男性12例，平均年齡41.79±9.09歲。入選標準：根據《中國高血壓防治指南2018年修訂版》建議的高血壓診斷標準[6]，所有高血壓患者需滿足如下條件：① 年齡：18～60歲；② 收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg；③ 初次診斷為高血壓(病史>2周)，未服用過任何類型的降壓藥物；④ 簽署知情同意書。選取20例年齡與性別匹配的正常血壓健康志愿者(收縮壓≤120 mmHg且舒張壓≤80 mmHg)納入對照組。排除合并其它疾病的患者，如急性感染、腫瘤、糖尿病、冠心病、慢性腎病、血液病等。

1.1.2實驗動物 10周齡SPF級雄性SHR、WKY及SD大鼠購自維通利華，許可證號：SCXK(京)2016-0006。本論文遵守美國NIH發(fā)布的實驗動物保護和使用指南(8th Edition，National Research Council，2011)，且動物實驗已通過首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院動物實驗倫理審查(2020-動-212)。

1.2 實驗材料

1.2.1主要試劑 PBS緩沖液(備ZLI-9062，中杉金橋)、逆轉錄試劑盒(638316，TaKaRa公司，日本)、qRT-PCR試劑盒(638316，TaKaRa公司，日本)、引物設計(TaKaRa公司，日本)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S,碧云天公司)、、預制膠(NP0321BOX，Invitrogen，美國)、Qiazol Lysis Reagent(77064，Qiagen，美國)、電泳緩沖液(NP0007，NuPAGE，美國)、Exo-Fect SEVs轉染試劑盒(EXFT20A-1，SBI，美國)等。

1.2.2主要儀器 熒光定量PCR儀7500(ABI，美國)、微量分光光度計和熒光分光光度計Nanodrop(Thermo Scientific，美國)、超速離心機XPN100(Beckman，美國)、XCell SureLock 小型電泳槽(Thermo Fisher，美國)、旋渦混合儀(Vortex，美國)、酶標儀(Thermo Fisher，美國)、高壓滅菌鍋(松下公司，日本)等。

1.3 方法

1.3.1人血漿的收集 空腹坐位休息10 min后采集肘靜脈血12 mL，置于抗凝管(含EDTA或檸檬酸鈉)中，4 ℃條件下靜置3～4 h，3 000 r·min-1，4 ℃離心10 min除去大的細胞碎片，取上清即為血漿，將血漿分裝(1.5 mL Ep管)并標記，送樣前凍存于-80 ℃冰箱。干冰運輸。

1.3.2大鼠采血 腹腔注射水合氯醛麻醉，開腹暴露下腔靜脈。術者右手持穿刺針，針尖斜面朝下，入針角度約25°～30°，朝向心端方向刺入，深度以5 mm左右為宜。抽血完畢,4 ℃下靜置3～4 h，3 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清即為血漿，將血漿分裝(1.5 mL Ep管)并標記，送樣前凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.3外泌體提取 每個標本吸取血漿1 000 μL，4 ℃條件下，300×g，離心10 min，取上清液，2 000×g，離心10 min，取上清液，10 000×g，離心30 min，取上清液至超速離心管中，用PBS配平后放入超速離心機中，設置4 ℃，100 000×g，離心70 min，取沉淀物，將沉淀物應用PBS重懸后，4 ℃條件下，給予100 000×g，離心70 min，摒除上清液得到沉淀物，此沉淀物即為血漿外泌體。

1.3.4外泌體鑒定 用50～100 μL 2%多聚甲醛固定液(Paraformaldehyde，PFA)重懸外泌體，取5 μL外泌體懸液滴加到Formvar-carbon載樣銅網上，在干燥環(huán)境下讓Formvar膜吸收20 min，然后放置在PBS液中清洗，然后在50 μL的1%戊二醛液中固定5 min，用100 μL的三蒸水清洗大概2 min(共洗3次)，用50 μL的草酸雙氧鈾液滴在銅網上進行染色處理，時間5 min，并繼續(xù)用三蒸水清洗3次，每次2 min。將銅網放置在空氣中干燥5～10 min，在80 kV的電壓下拍攝外泌體電鏡照片。

1.3.5外泌體蛋白提取 向離心沉淀的外泌體樣品中加入蛋白裂解液，并加入PMSF，終濃度為1 mmol·L-1。在冰上裂解30 min，4 ℃離心，設置條件為10 000 r·min-1，15 min，離心后取上清液，根據蛋白濃度測定的結果加入相應量的蛋白上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min使蛋白變性。

1.3.6尾靜脈注射外泌體 將10 W齡SHR和WKY大鼠血漿中的外泌體提取出來，通過尾靜脈注射入同齡SD大鼠體內，25 μg·d-1，連續(xù)注射3 d。

1.3.7外泌體轉染 按照Exo-Fest SEVs轉染試劑盒操作，(1)Exosome轉染實驗：① 準備1.5 mL EP管，如下混合:10 μL Exo-Fect solution+20 μL核酸(20 pmol si/miRNA，1 μg mRNA或5 μg plasmid DNA)+70 μL無菌1xPBS+50 μL無菌1xPBS重懸好的exosome=150 μL轉染反應體系。② 輕彈或顛倒EP管3次以混勻反應體系，不可渦旋。③ 將EP管置于37 ℃混合器孵育10 min后，立即置于冰上。④ 終止反應：在轉染反應體系中加入試劑盒提供的ExoQuick-TC 30 μL，上下顛倒6次以混勻，不可渦旋。⑤ 將EP管置于冰上(或4 ℃)孵育30 min。⑥ 最高轉速13 000～14 000 r·min-1離心3 min。⑦ 棄去上清，300 μL 1xPBS重懸轉染好的exosome沉淀。⑧ 轉染好的外泌體可用于添加入靶細胞，或者其他體內實驗。(2)將Exo-Fect轉染的exosome加入靶細胞：① 6孔板每孔使用去exosme的FBS培養(yǎng)約為1×105個細胞，添加至少150 μL轉染好的exosome。可根據實驗需求調節(jié)添加比例。② 繼續(xù)細胞培養(yǎng)2～24 h，在熒光顯微鏡下觀察。陽性對照Texas Red-labeled siRNA，使用熒光顯微鏡上標準RFP濾鏡設置可觀察其通過exosome運輸至靶細胞的過程。

1.3.8蛋白免疫印跡 采用Invitrogen NuPAGE Bis-Tris預制膠，通過含有蛋白酶抑制劑的裂解液重懸血清外泌體后提取總蛋白進行分析，將提取后的蛋白加入NuPAGE Bis-Tris預制膠電泳中分離，將其轉移到NC膜上，以5% BSA封閉1 h，anti-HSP70及anti-CD63一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS緩沖液沖洗后二抗孵育1 h，用Bio-rad公司的顯影裝置系統(tǒng)進行曝光并記錄曝光結果。

1.3.9提取外泌體總RNA 采用Qiagen公司exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit，先加入Qiazol裂解，后續(xù)加入氯仿、無水乙醇并離心，加入RWT Buffer、RWE buffer至吸附柱，反復離心得到外泌體總RNA。

1.3.10RT-qPCR 采用TaKaRa公司生產的Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit將提取的總RNAs反轉錄為cDNA，反應條件為：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min。PCR反應體系：9 μL TB Green Advantage Premix(2×)、0.5 μL ROX Dye (50×)、0.5 μL miRNA-specific primer(10 μmol·L-1)、0.5 μL mRQ 3’Primer(10 μmol·L-1)、2 μL cDNA、9μL ddH2O。總計25 μL。反應程序：95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s。共40個循環(huán)。儀器采用熒光定量PCR儀7500(ABI公司，美國)。實驗所用引物序列由TaKaRa公司提供，TaKaRa公司作為專利未公布引物序列。以內參U6為miRNA相對定量參照基因。每份標本設置3個復孔。對每個檢測目標基因設定相同的循環(huán)閾值(cycle threshold,CT值)極限和截點。計算miRNA表達量,計算公式:2-ΔΔCT來比較組間差異,其中ΔCT=CT(目的基因)-CT(內參基因)。

1.3.11臍靜脈內皮細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內皮細胞購自ATCC公司，使用完全內皮細胞培養(yǎng)基(Scien Cell公司)進行培養(yǎng)。實驗使用第4～5代細胞。

1.3.12細胞轉染 使用lipofectamin 3000將miR-17-5p的模擬物轉染至HUVECs中。

2 結果

2.1 基本資料高血壓患者組及對照組臨床特征見Tab 1。

Tab 1 Clinical characteristics of selected patients

2.2 血漿外泌體的鑒定透射電鏡檢測的結果顯示，提取的外泌體呈圓形或類圓形囊泡狀，囊泡外周可見其膜性結構，可單個分布也可聚集成群，其內可見低電子密度物質，直徑分布于 20～120 nm(Fig 1A)。Western blot的結果顯示外泌體中表達特異性標志分子CD9、CD63和Alix(Fig 1B)。

Fig 1 Identification of plasma exosomes from WKY and SHR

2.3 SHR的血漿外泌體可使SD大鼠的血壓顯著升高將10W齡SHR和WKY血漿中的外泌體提取出來，通過尾靜脈注射入同齡SD大鼠體內，25 μg·d-1連續(xù)注射3 d。4周后頸內動脈插管法檢測的結果顯示，接受SHR血漿外泌體(SHR-exos)的SD大鼠(n=5)的收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、以及平均動脈壓(mean blood pressure，MBP)均高于接受WKY血漿外泌體(WKY-exos)的大鼠(n=6)(Fig 2)。

2.4 高血壓患者組及SHR組的血漿來源外泌體miRNA熒光定量PCR驗證我們從課題組前期高通量測序的結果[4]中選取了表達差異明顯的8個exo-miRNAs，用real time PCR的方法在原發(fā)性高血壓患者及另一批SHR大鼠中進行了驗證。結果顯示,miR-17-5p、miR-206-3p、miR-218-5p 3個miRNAs的結果與測序結果一致：miR-17-5p與miR-218-5p在高血壓患者及SHR-exos中的表達升高，而miR-206-3p在高血壓患者及SHR-exos中的表達降低(Fig 3)。

Fig 3 qPCR verification results

2.5 miR-17-5p在SHR-exos促進正常大鼠血壓升高過程中發(fā)揮重要作用為了明確介導SHR血漿外泌體促進正常大鼠血壓升高作用的關鍵miRNA，我們將miR-17-5p inhibitors、miR-218-5p inhibitors以及miR-206-3p mimics分別轉染入SHR的血漿外泌體中后再通過尾靜脈注射入SD大鼠體內。4周后頸內動脈插管法檢測的結果顯示, miR-17-5p inhibitors可以減弱SHR-exos升高血壓的作用，而miR-218-5p inhibitors和miR-206-3p mimics對SHR-exos升高血壓的作用則沒有影響(Fig 4)，提示miR-17-5p在SHR大鼠血漿外泌體促進正常大鼠血壓升高過程中發(fā)揮了重要的作用。

Fig 4 miR-17-5p inhibitors significantly attenuated effect of SHR-exos on raising SBP, DBP and MBP in WKYs,

2.6 miR-17-5p 可下調LKB1及PTEN的表達為了明確exo-miR-17-5p參與高血壓發(fā)生發(fā)展的機制，我們用TargetScan對miR-17-5p的靶基因進行了預測，發(fā)現(xiàn)肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)可能是miR-17-5p的靶基因，并用Western blot的方法在體外培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中進行了初步驗證，結果表明miR-17-5p模擬物(mimics)可以下調LKB1的表達，提示LKB1很可能是miR-17-5p的靶基因。此外，已有研究證明，同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)也是miR-17-5p的靶基因，我們的結果亦表明，轉染miR-17-5p mimics可以下調PTEN的表達(Fig 5)。這些結果表明，miR-17-5p很有可能是通過調控LKB1和PTEN來發(fā)揮升高血壓的作用。

Fig 5 miR-17-5p down-regulated expression of LKB1 and PTEN

3 討論

原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制主要與遺傳機制(單基因、多基因遺傳模式和基因多態(tài)性等)、大動脈彈性減退、周圍血管阻力升高、腎臟排鈉能力下降、交感神經系統(tǒng)α受體功能亢進、壓力感受器功能下降和血小板功能減退等有關[5]。在分子水平上高血壓發(fā)生發(fā)展的許多方面仍然未知。

外泌體的細胞微泡結構使其成為循環(huán)中遺傳物質或蛋白質的運輸載體，其中包含著大量的DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白質和脂質[7]，而miRNA約占外泌體總RNA的76.2%[8]，miRNA是數(shù)量最多的外泌體成分。鑒于上述miRNAs在血清中的變化和其潛在生物學功能，考慮到外泌體是由被激活的或處于疾病狀態(tài)下的細胞分泌到外周循環(huán)中的，我們有理由相信循環(huán)外泌體介導的miRNAs可以在高血壓患者中差異表達。但是，外泌體介導的miRNA與高血壓方面的研究多見于尿液方面。腎臟中多種細胞分泌的外泌體可在尿液中檢測到，研究證實尿液外泌體中離子通道相關蛋白如噻嗪類敏感的鈉氯離子轉運蛋白(Na+-Cl-cotransporter，NCC)，水通道蛋白2等與高血壓相關[9]。miRNA表達譜檢測發(fā)現(xiàn)，高血壓患者尿外泌體中含有多種miRNAs[10]。

有研究報道，靜脈注射到動物體內的外泌體可隨血液循環(huán)到達各種組織[14-17]。Vandergriff等[11]通過尾靜脈注射6×109個CHP-XO(CHP targeted exosomes，心臟歸巢肽靶向外泌體)后，在d 21觀察到CHP-XO促進了心臟缺血/再灌注損傷大鼠的心臟修復、增加了心臟增殖以及促進了血管生成。Zhang等[12]將25 μg間充質干細胞衍生的外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-EXO)通過尾靜脈注射入肺動脈高壓大鼠體內，4周后觀察到MSC-EXO可降低肺動脈高壓大鼠的右室收縮壓、肺動脈收縮壓和肺血管重構程度。因此，本研究將SHR血漿外泌體注射入血壓正常大鼠尾靜脈，在4周后對大鼠的血壓進行了檢測，與預期一致，注射SHR-exo大鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓均明顯升高，提示血漿外泌體可能參與高血壓的發(fā)生發(fā)展，與Otani等[13]的研究結果一致。

課題組前期已報道，SHR大鼠血漿外泌體中miRNA表達譜與WKY大鼠相比差異明顯[4]，我們進一步挑選了表達差異明顯的8個exo-miRNAs，用real time PCR的方法在原發(fā)性高血壓患者及另一批SHR大鼠中進行了驗證。結果發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、miR-206-3p、miR-218-5p 3個miRNAs的結果與測序結果一致：miR-17-5p與miR-218-5p在高血壓患者及SHR-exos中的表達升高，而miR-206-3p在高血壓患者及SHR-exos中的表達降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)外泌體中miR-17-5p表達升高，可能與高血壓的發(fā)病機制有關。miR-17-5p屬于miR-17-92基因簇，它和miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92a被RNase Ⅲ酶切割，從而由Pri-miR-17-92加工成7個單獨的成熟miRNA。miR-17-5p位于13q31.3上1個約長7 kb的初級轉錄本C13orf25的第一個內含子上，在淋巴瘤、結直腸癌、肺癌患者中，該位點的基因常常會高表達，發(fā)揮促癌或者抑癌的作用。

本研究結果表明，在HUVECs中miR-17-5p可下調LKB1的表達。LKB1即絲氨酸-蘇氨酸激酶11(serine-threonine kinase 11，STK11),其基因定位于19號染色體短臂13.3區(qū)域，是一種保守的抑癌基因[14]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是調節(jié)能量代謝的關鍵分子，在多種細胞中可以被LKB1激活。AMPK被激活后會磷酸化幾個關鍵蛋白，并介導參與代謝調節(jié)的多種下游途徑：減少糖異生、脂肪酸和膽固醇合成、增加肌肉細胞葡萄糖轉運、脂肪酸氧化和線粒體生物發(fā)生。LKB1可通過AMPK-小窩蛋白1(caveolin-1)-eNOS途徑調節(jié)內皮細胞的功能和血壓，內皮特異性敲除LKB1的小鼠表現(xiàn)出內皮細胞功能的障礙和高血壓[15]。Dolinsky等[16]發(fā)現(xiàn)高劑量白藜蘆醇(RESV)可通過LKB1-AMPK-eNOS信號轉導軸來減少氧化應激、改善血管功能、減輕高血壓并防止心臟肥大。

此外，研究報道PTEN也是miR-17-5p的靶基因[17]。PTEN是一種腫瘤抑制因子，也是突變率最高的幾個抑癌因子之一，可通過其脂質磷酸酶活性來拮抗磷脂酰肌醇三激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號通路，從而控制一系列細胞生理過程[18]。AKT通過對內皮細胞的影響在病理和生理性血管生成中都發(fā)揮著重要作用。在內皮細胞中，P13K-AKT信號通路可被血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)強烈激活，而AKT靶標的磷酸化可能有助于內皮細胞的存活、生長及增殖。此外，通過對S1177的直接磷酸化，AKT激活內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)。活化的eNOS產生釋放的NO可以刺激血管舒張、血管重塑和血管生成，在高血壓中發(fā)揮著重要的作用。我們的結果表明，在HUVECs中miR-17-5p的確可以下調PTEN的表達，提示PTEN-PI3K/AKT信號通路也參與了循環(huán)exo-miR-17-5p升高血壓的作用。

綜上所述，本研究的結果表明循環(huán)外泌體中miR-17-5p在高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，且其升壓作用可能是通過對LKB1/PTEN信號的調節(jié)實現(xiàn)的。外泌體miR-17-5p可能成為高血壓新的治療靶點。