人參皂苷Rg1對慢性腦缺血導致白質損傷的影響

李欣娛，楚世峰，李晚晚，賀文彬，陳乃宏，

(1.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西 太原 030619；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所神經(jīng)科學中心，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050；3.國家衛(wèi)生健康委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心，北京 100044)

大腦內部神經(jīng)纖維聚集的地方，顏色淺，稱為腦白質。腦白質由被髓鞘包裹著的神經(jīng)軸突組成，控制著神經(jīng)元共享的訊號，協(xié)調腦區(qū)之間的正常運作。許多因素會導致腦白質病變，如感染、中毒、神經(jīng)退行性疾病、外傷和慢性腦缺血等。腦白質病變會損傷人的認知和運動協(xié)調能力[1]，且越來越趨于年輕化。目前，由于缺乏安全有效的治療方法，白質病變的治療多以預防為主。人參具有增強學習記憶能力、提高免疫力[2]和改善心腦血管疾病的作用。本課題組研究[3]證明人參皂苷Rg1對急性腦缺血損傷具有保護作用，而對慢性缺血造成腦白質的損傷尚未進行深入研究。本實驗采用BCAS(bilateral carotid artery stenosis，BCAS)方法[4]建立腦白質損傷模型，在此基礎上探究人參皂苷Rg1對慢性腦白質損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物健康♂性C57BL/6小鼠，50只，8周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司(SYXK(京)2019-0023)。體質量(18～22) g，SPF級。所有動物均飼養(yǎng)于SPF級動物房，恒溫(22±1) ℃，相對濕度55%±10%，12/12 h明暗交替，自由獲取食物和水。所有小鼠在進行正式實驗前于該環(huán)境適應1周。

1.2 藥品與試劑人參皂苷Rg1由吉林大學化學學院教研室提供，純度≥98%；鹽酸多奈哌齊，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，批準文號：國藥準字H20050978；異氟烷購買于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；固藍染液、碳酸鋰溶液購于武漢賽維爾生物有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL超敏發(fā)光液等購于北京普利萊基因有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、β-actin Mouse Antibody等購于美國Sigma公司；Anti-Myelin Basic Protein antibody(貨號：ab11159)、Anti-Olig2 antibody(貨號：ab109186)等購于英國Abcam；驢抗兔IgG熒光二抗(批號：2273718)、驢抗小鼠IgG熒光二抗(批號：1975519)等購于美國Invitrogen公司。

1.3 儀器雙目體式顯微鏡，深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號77001S；0.18 mm彈簧微線圈，Sawane Spring Co，Shizuoka，Japan；激光多普勒血流儀，英國Moor儀器公司；BX51正置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Image Quant LAS-4000 min型化學發(fā)光成像儀，美國GE公司；激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡公司。

1.4 方法

1.4.1動物分組、模型制備及給藥 將50只C57BL/6小鼠隨機分為Sham組、BCAS模型組、陽性藥組、Rg1低劑量組、Rg1高劑量組，每組10只。小鼠用異氟烷維持麻醉，使用加熱墊將其體溫保持在37 ℃左右，從頸部正中開口，剝離兩側相關肌肉，分離出兩側迷走神經(jīng)VN(vagus nerve，VN)和頸總動脈CCA(common carotid artery，CCA)，將0.18 mm彈簧微線圈纏繞在CCA上，注意不要損傷VN。Sham組只分離相關血管，不纏繞彈簧，術后立即縫合傷口并消毒。術后1 d，陽性藥組小鼠灌胃鹽酸多奈哌齊0.5 mg·kg-1，Rg1低劑量組、高劑量組分別灌胃Rg1 5 mg·kg-1、10 mg·kg-1，假手術組、BCAS模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，不間斷30 d。

1.4.2體重及CBF值檢測 在造模過程中，每天稱量各組小鼠的體重并記錄。在造模前，沿失狀正中線將小鼠頭部皮膚剪開，用激光多普勒血流儀監(jiān)測小鼠術前皮層CBF(cerebral blood flow，CBF)值，并監(jiān)測術后、術后2 h、1 d、3 d、7 d、14 d、30 d皮層CBF值。

1.4.3行為學檢測

1.4.3.1 爬桿實驗 動物給藥30 d后，進行爬桿實驗，爬桿實驗通過記錄小鼠由桿的頂端往下爬到底部所需時間，來檢測動物的運動協(xié)調能力[2]。將高50 cm、直徑1 cm、由紗布包裹的爬桿裝置放置于一個木箱中。在小鼠適應環(huán)境后，將其頭部朝上放置于爬桿頂部的木質小球上，引導小鼠向下爬行。每只小鼠訓練3次，以確保它們在被放在球上的時候有向下爬的意識。記錄小鼠從開始向下爬到四肢全部著地所用的時間。共進行5次測試，每次測試間隔至少30 min，選取5次測試的平均值進行統(tǒng)計分析。

1.4.3.2 新物體識別實驗 新物體識別實驗分為熟悉、適應、測試3個階段。在動物給藥30 d后，進行熟悉階段的實驗，首先將一只小鼠放在長、寬、高均為50 cm的木箱中，使其熟悉5 min，然后取出。再將下一只小鼠放入之前，噴灑10%的乙醇，消除上只動物的殘留氣味。依此，使所有組小鼠都熟悉木箱環(huán)境。d 2，在木箱對稱位置放入兩個相同大小的長方形木塊，兩個木塊的位置距離木箱中心、側壁距離相等。將小鼠放入木箱中距離兩個物體等距位置處，使其適應5 min，觀察小鼠的行走路徑，用Smart 3.0軟件記錄小鼠對物體的探究時間，小鼠鼻子距物體1 cm之內視為其對物體有探索行為。d 3，將兩個長方形木塊中的一個換為三角形木塊，檢測各小鼠5 min內，對兩個物體的探索時間，并分析其新物體識別指數(shù)。

1.4.3.3 Y迷宮 Y迷宮由三條臂組成，每條臂長40 cm、寬5 cm、高10 cm，它們與中心點成120°角，按順時針順序將三條臂分別標記為A、B、C，在每條臂中貼上不同形狀的圖形作為標記。將小鼠從A臂末端放入，讓其自由活動8 min，手動記錄小鼠進入每條臂的順序，統(tǒng)計其連續(xù)交替次數(shù)，如ABC、CAB和最大交替次數(shù)(總交替次數(shù)-2)，計算其自主交替次數(shù)，將進入總臂數(shù)不足8的小鼠排除。

1.4.4固藍(luxol fast blue，LFB)染色 小鼠進行完行為學測試后，用水合氯醛(400 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，PBS灌流取腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋，將包埋的腦組織胼胝體部位切為4 μm的石蠟切片用于LFB染色。將石蠟切片置于二甲苯中15 min×2次進行脫蠟，乙醇梯度水化：100%乙醇5 min×2，90%、80%、70%、60%的乙醇各5 min，然后用雙蒸水沖洗5 min。固藍染液于60 ℃水浴鍋中預熱30 min，然后將切片置于固藍染液中于60 ℃染色4 h。切片冷卻至室溫后，流水沖洗1 min，浸入70%乙醇中10 s。然后再次流水沖洗切片1 min，并浸入碳酸鋰溶液1 min進行分化。重復以上步驟，直到背景為無色或淺藍色，此時神經(jīng)髓鞘呈亮藍色。最后，將切片逆濃度脫水：80%、90%乙醇各2 min，100%乙醇2 min×2次，二甲苯3 min×2次進行脫水，隨后用中性樹脂封片。BX51正置光學顯微鏡下觀察并拍攝圖像，便于后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.4.5尼氏染色 依照1.4.4中脫蠟和乙醇梯度水化流程進行操作，完成后將切片置于焦油紫染液中于60 ℃染色30 s。蒸餾水洗凈染料后，將切片分別置于70%、80%、95%以及100%乙醇中脫水，再用二甲苯透化，中性樹膠封片。BX51正置光學顯微鏡下觀察并拍攝圖像，便于后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.4.6Western blot實驗 小鼠進行完行為學測試后，用水合氯醛(400 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，斷頭取腦，于冰上分離胼胝體部分，立即于-80 ℃凍存。提取胼胝體組織總蛋白，BCA試劑盒定量，用SDS-PAGE凝膠電泳，12%的分離膠分離MBP。轉膜，5%BSA封閉2 h，根據(jù)目的蛋白分子量裁膜，隨后加一抗(MBP，1 ∶1 000；β-actin，1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜。然后TBST洗10 min×3次，加入相應二抗，常溫孵育2 h，回收二抗，TBST洗10 min×3次。于Image Quant LAS-4000 min型化學發(fā)光成像儀成像，用ImageJ軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.4.7免疫熒光實驗 將石蠟切片置于二甲苯中15 min×2次進行脫蠟，然后依照“1.4.4”進行乙醇梯度水化，再用雙蒸水、PBS洗5 min。抗原修復冷卻至室溫后，PBS洗5 min×3次，后用0.5%的TritonX-100透化15 min，PBS洗5 min×3次。用免疫組化筆圈住腦片周圍，滴加封閉液，室溫封閉30 min。然后棄去封閉液，滴加一抗(MBP，1 ∶200；Olig2，1 ∶100)，切片置于濕盒中4 ℃孵育過夜。d 2，復溫30 min，PBST洗10 min×3次。加相應的二抗室溫避光孵育2 h，PBST避光洗10 min×3次，甘油封片，透明指甲油固定四周。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝圖像，進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 體質量、CBF值變化實驗造模后1～3 d內，與Sham組相比，BCAS模型組和給藥組小鼠體質量明顯下降(Fig 1A)，在d 7～30內體質量明顯上升，達到初始水平，而BCAS模型組小鼠與給藥組小鼠間無顯著性差異。動物進行手術后，立即檢測其皮層CBF值，發(fā)現(xiàn)Sham組小鼠CBF值下降為術前的98.73%±6.65%，30 d內CBF值無明顯波動，BCAS模型組小鼠CBF值下降為術前的55.13%±3.5%，30 d內CBF值逐漸上升，最終恢復為初始的80.48%±5.71%(Fig 1B)。

Fig 1 Effect of ginsenoside Rg1 on body weight and CBF values of mice induced by BCAS during treatment stage (n=7-9)

2.2 Rg1對腦白質損傷小鼠運動協(xié)調和認知能力的影響

2.2.1爬桿實驗 爬桿檢測結果(Fig 2A)表明，與Sham組相比，BCAS模型組的小鼠爬桿所用時間明顯延長，說明其運動協(xié)調能力下降，與BCAS模型組相比，鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1治療后，小鼠爬桿時間明顯降低，與BCAS模型組相比差異有顯著性，說明鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1能夠改善腦白質損傷引起的行為學障礙。

Fig 2 Effect of ginsenoside Rg1 on movement coordination and cognitive ability in BCAS mice

2.2.2新物體識別實驗 新物體識別實驗被廣泛用于評價動物的學習記憶能力[5]，新物體識別實驗結果(Fig 2B)表明，與Sham組比較，BCAS模型組小鼠新物體識別指數(shù)明顯降低，認知能力嚴重受損。而給予鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1治療后，小鼠新物體識別指數(shù)與BCAS模型組相比差異有顯著性，認知能力得到明顯改善。

2.2.3Y迷宮實驗 Y迷宮實驗模型用來研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力，這種迷宮利用了嚙齒類動物對新異環(huán)境天然探究的自然習性，不需要動物學習任何規(guī)則來趨利避害，能夠有效地反映出動物對新異環(huán)境的識別記憶能力[6]。Y迷宮的實驗結果(Fig 2C)表明，與Sham組相比，BCAS模型組的小鼠自主交替次數(shù)明顯減少，空間記憶能力明顯下降，與Sham組相比差異有顯著性，而給予鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1治療的小鼠，其自主交替次數(shù)增加，與BCAS模型組相比差異有顯著性，表明陽性藥鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1能改善腦缺血引起的腦白質損傷，提高空間記憶能力。

2.3 Rg1對腦白質損傷小鼠髓鞘的影響

2.3.1LFB染色 LFB染色常用來檢測髓鞘的形態(tài)結構和病理損傷[7]。Sham組的小鼠胼胝體髓鞘致密，顏色深，而BCAS造模的小鼠，其胼胝體髓鞘疏松，顏色淺，大部分崩解且呈空泡狀(Fig 3A)，經(jīng)統(tǒng)計比較，兩組IOD(integrated optical density，IOD)值(Fig 3B)有顯著性差異，而給予鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1治療后，其髓鞘明顯顏色加深，排列致密，崩解和空泡狀減少，與模型組相比差異有顯著性，說明人參皂苷Rg1能有效改善髓鞘損傷。

Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on pathological changes in BCAS mice

2.3.2Nissl染色 Sham組小鼠的胼胝體神經(jīng)元Nissl+細胞數(shù)量較多，尼氏小體顏色深，細胞核完整，而BCAS模型組小鼠的胼胝體神經(jīng)元Nissl+細胞數(shù)明顯減少，且細胞核固縮，尼氏小體色淺(Fig 4A)。在給予鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1給藥治療后，小鼠胼胝體神經(jīng)元Nissl+細胞數(shù)有明顯增加(Fig 4B)，細胞核固縮程度減弱，尼氏小體顏色加深，與模型組相比差異有顯著性，說明人參皂苷Rg1對腦白質神經(jīng)元損傷有明顯的改善作用。

Fig 4 Effect of ginsenoside Rg1 on pathological changes in BCAS mice

2.4 Rg1對髓鞘堿性蛋白MBP表達水平的影響

2.4.1Western blot MBP是檢測髓鞘結構完整性最常用的標記蛋白之一[8]。Western blot檢測結果(Fig 5A，5B)表明，與Sham組相比，BCAS模型組MBP蛋白表達水平明顯降低，兩者相比差異有顯著性，而給予鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1治療的小鼠其MBP蛋白水平相比BCAS模型組升高，與其相比差異有顯著性。說明人參皂苷Rg1能明顯提高MBP蛋白表達水平，對腦白質損傷引起的髓鞘脫落有明顯的治療作用。

Fig 5 Effect of ginsenoside Rg1 on expression of MBP

2.4.2免疫熒光 免疫熒光實驗結果(Fig 6A，6B)表明，BCAS模型組小鼠的MBP熒光強度明顯降低，與Sham組相比，兩者差異有顯著性，而給予鹽酸多奈哌齊和人參皂苷Rg1治療的小鼠，其MBP的熒光強度有明顯的提高，與BCAS模型組相比差異有顯著性，說明人參皂苷Rg1能夠明顯促進MBP蛋白的表達，改善腦缺血引起的腦白質損傷。

Fig 6 Effect of ginsenoside Rg1 on expression of MBP

3 討論

目前許多研究都表明，在大腦缺血/缺氧的情況下，腦白質會受損[9]，從而影響其對神經(jīng)信號的傳導作用。Shibata等[4]，Wang等[10]都通過雙側頸總動脈狹窄手術建立了成功的慢性腦缺血白質損傷模型，我們也基于此，建立了BCAS模型，其CBF值指標與文獻報道的一致，在術后動物皮層CBF血流值降低為初始的55.13%±3.5%[11]，證明模型建立成功。BCAS模型操作簡單易重復，不損傷小鼠眼動脈，避免了對小鼠行為學的測試結果的干擾。相對于傳統(tǒng)飼料喂養(yǎng)和2VO的造模方式，有極大的優(yōu)勢，對藥物的評價結果也更為準確。目前髓鞘損傷后的修復成為治療腦白質損傷主要手段，現(xiàn)代研究證明[12-15]，人參具有增強機體免疫力、改善學習記憶和心腦血管疾病的作用，且本課題組也已證明人參主要成分人參皂苷Rg1能夠改善急性腦缺血造成的神經(jīng)損傷[3]，而對于人參皂苷Rg1能否改善慢性腦缺血造成的白質損傷尚未及進行深入研究。鹽酸多奈哌齊已被證明對腦缺血/再灌注損傷有很好的神經(jīng)保護作用[16]，所以我們選用鹽酸多奈哌齊作為陽性藥進行治療。在給予藥物治療后，發(fā)現(xiàn)各治療組小鼠的CBF值差異無顯著性，說明人參皂苷Rg1對小鼠的CBF值影響不大，與已有研究的結果一致。行為學測試結果表明，人參皂苷Rg1明顯提高了小鼠的物體識別和自主活動能力，明顯改善了小鼠因腦白質損傷導致的認知障礙和運動失調。胼胝體連接左右大腦半球，通常是檢測腦白質損傷的代表性部位[17]，LFB染色和尼氏染色結果表明，人參皂苷Rg1組能明顯改善胼胝體已損傷髓鞘的空泡狀結構，減弱髓鞘的疏松度，增加Nissl+神經(jīng)元的表達，對髓鞘損傷有明顯的修復作用。少突膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成髓鞘細胞，少突膠質前體細胞在髓鞘損傷后會遷移到受損部位，進而分化成為成熟的少突膠質細胞形成髓鞘，改善腦白質的損傷，Oligo2是少突膠質細胞譜系特殊標志物，通過Western blot和免疫熒光實驗，我們檢測到人參皂苷Rg1組能明顯促進MBP和Olig2的表達，維持髓鞘的完整性。本實驗的行為學和病理學檢測結果都表明，人參皂苷Rg1 10 mg·kg-1的劑量比5 mg·kg-1的改善效果要好。

綜上，人參皂苷Rg1能明顯改善因慢性腦缺血造成的腦白質損傷。本研究為人參皂苷Rg1研究腦白質損傷提供了理論依據(jù)，為治療腦白質損傷的研究提供了備選藥物，但其改善的作用機制尚需進行深入研究。