馥感啉口服液通過TGF-β1/Smad3信號通路改善肥胖哮喘小鼠氣道重塑

李小英，郭健敏，張文強，戴錦龍，楊 威，江 濤

(1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東萊恩醫藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評價研究企業重點實驗室，國家中藥現代化工程技術研究中心中藥非臨床評價分中心，廣東省創新藥物評價與研究工程技術研究中心，廣東 廣州 510990)

支氣管哮喘為兒科常見疾病，據文獻報道，全球哮喘患者約 2 億左右，其中小兒支氣管哮喘占 35% 以上，患病率約為1%～8%，發病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。近年來多項研究發現，肥胖型哮喘更容易導致哮喘急性發作，且即使給予一線抗哮喘藥物治療，肥胖型哮喘患者的病情依然控制不佳，所以迫切需要有效的補充及替代方法來治療肥胖型哮喘[3]。

肥胖哮喘的特征表現為氣道重塑、氣道高反應性(Airway hyperresponsiveness，AHR)及慢性氣道炎癥。轉化生長因子β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種多效性的細胞因子，在哮喘患者中顯著高于正常人，可通過多種機制如誘導纖維母細胞增生、膠原纖維及細胞外基質合成等促使結締組織合成增加，介導下游靶點Smad3發生磷酸化，促使氣道重塑發生[4]。近年來，TGF-β1/Smad3信號級聯已經成為氣道炎癥及氣道重塑研究的熱點[5-6]。

馥感啉口服液(以下簡稱馥感啉，FGL)復方中主要含黃芪、浙貝母、麻黃、甘草等成分，具有清熱解毒、止咳平喘、益氣疏表的功效，臨床上主要用于小兒反復感冒所致發熱、咳嗽、氣喘、咽喉腫痛等癥狀。本研究通過卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)聯合高脂飼料的方法建立肥胖哮喘小鼠模型，并與硫酸特布他林進行比較，觀察馥感啉對肥胖哮喘小鼠的治療效果，初步探討馥感啉治療肥胖哮喘機制。

1 材料

1.1 動物健康C57 BL/6小鼠102只，雌雄各半，PND16- PND18，體質量(8.5～14.8)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004。動物飼養于廣東萊恩醫藥研究院SPF級動物房，嚴格按照國際AAALAC和《廣東省實驗動物管理條例》要求進行研究，研究過程符合動物倫理和福利要求。

1.2 主要試劑馥感啉(廣州一品紅制藥有限公司，批號：19120501)主要有效成分黃芪甲苷(大于80 mg·L-1)、貝母素甲、鹽酸麻黃堿等，濃度1 079 mg·L-1，棕褐色液體，味甜、微苦、澀，密封，置陰涼處保存；硫酸特布他林片(阿斯利康制藥有限公司，批號：1709089)；卵清蛋白(OVA，Sigma公司，SLBK7542V)；Dorminal 20%(Alfasan Intenational B.V，批號為1709296-02)；IgE、TGF-β1、Smad3、SP ELISA試劑盒(廣州開晨生物科技有限公司；E20200701A)；Smad3抗體，美國abcam，批號：ab84177；SARA抗體，中國安諾倫，批號22033-1-AP；高脂飼料D12492(北京科澳協力飼料有限公司)。

1.3 主要儀器電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；低速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。酶標分析儀(BioTek，Synergy LX，美國)；超聲霧化器(歐姆龍健康醫療有限公司)；振蕩式肺功能檢測系統(Flexivent，SCIREQ，法國)；熒光顯微鏡成像系統(Keyence，BZ-X800，日本)。

2 方法

2.1 動物處理在動物適應性觀察結束之后，隨機挑選8只為陰性對照組(Control)，正常維持飼料(含脂肪10%)喂養；其他動物高脂飼料(蛋白:碳水化合物:脂肪=1 ∶1 ∶3)喂養。六周后分組，選取體重大于陰性對照組平均體重約20%的動物建立肥胖哮喘模型，分為肥胖組(Obesity model)、肥胖哮喘模型組(Obesity asthma model)、硫酸特布他林(Terbutaline)組0.4 mg·kg-1、馥感啉(FGL)5.86、11.72、23.44 g·kg-1組。哮喘模型建立：參考文獻[7]稍加改進，除陰性對照組外，其余各組通過腹腔注射10 mg·L-1OVA溶液 0.2 mL進行致敏，隔天1次，連續3次，觀察14 d后激發，激發時將OVA溶液10 mg·L-1霧化吸入，每天1次，每次3～5 min，連續7 d。陰性對照組以等量PBS溶液致敏和激發。采用灌胃給藥，于致敏d 1開始持續至動物處理，給藥體積30 mL·kg-1，每天1次，共26 d，陰性對照組和模型組給予等體積的純水；硫酸特布他林組于后5 d灌胃給藥，前21 d給予等體積的純水。

2.2 標本采集各組小鼠于最后一次激發后，測定肺功能。小鼠麻醉后，仰臥位于固定板上，頸部剃毛，消毒，頸部正中切口，暴露氣管，然后用眼科剪做一個倒T形切口，清潔創口后連接肺功能測定儀的專用管道插入小鼠氣管中，測定肺功能。肺功能測定結束后，腹主動脈采血并處死小鼠，打開胸腔，取左肺切片染色，右肺-80 ℃冷凍保存。

2.3 體質量及肺臟指數肥胖模型造模期間，每周稱質量1次，6周后，計算肥胖模型成功率；給藥期間動物每3 d稱量次體質量，并于末次處理時剖取動物肺臟，稱取質量，計算肺臟指數。其中，肥胖模型成功率=體質量大于陰性組平均體質量20%的動物數量/其余動物數量×100；肺臟指數(%)=肺臟重量/體質量×100。

2.4 呼吸功能評價方法于給藥d 26，霧化激發后，腹腔注射1% Dorminal(50 mg·kg-1)麻醉，暴露支氣管，做T型切口插管，連接肺功能震蕩儀測定呼吸系統阻力(Respiratory system resistance，Rrs)、呼吸系統順應性(Respiratory system compliance，Crs)、呼吸系統彈性(Respiratory system elasticity，Ers)。

2.5 肺部組織病理學檢查小鼠肺組織制備成厚度為3～5 μm的切片，分別進行HE 及Masson染色，光鏡下觀察病理變化。

2.6 白細胞總數及IgE的含量檢測肺功能測定結束后，利用腹主動脈采血方法對小鼠進行安樂死，并采集1～2 mL的血液，取約0.5 mL用乙二胺四乙酸抗凝，測定白細胞總數。剩余血液分離血漿后-20 ℃冷凍保存，采用ELISA法對小鼠血清中Ig E的含量進行檢測，具體操作均按試劑盒說明書所述的執行。

2.7 肺組織中TGF-β1、Smad3、SARA(Smad anchor for receptor activation)、P物質(substance P，SP)含量檢測取動物部分肺組織-80 ℃冷凍保存，4周內取出勻漿，吸取上清，采用ELISA法檢測TGF-β1、Smad3、SP含量。石蠟切片免疫組化檢測小鼠肺組織中Smad3及SARA蛋白表達。

3 結果

3.1 馥感啉對肥胖哮喘小鼠體質量及肺臟指數的影響與陰性對照組相比，給藥期間各組動物體質量均明顯增加(P<0.05)(Fig 1)。與肥胖哮喘模型組相比，馥感啉各組動物肺臟質量明顯降低(P<0.05)，肺臟系數降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見Tab 1。

Fig 1 Weight gain curve

Tab 1 Effect of Fuganlin oral liquid tablets on lung organ index of mice

3.2 馥感啉對肥胖哮喘小鼠呼吸功能指標的影響在給藥結束之后，檢測不同組小鼠的呼吸功能。結果發現，肥胖哮喘模型組Rrs和Ers明顯高于陰性對照組(P<0.05)，馥感啉治療后抑制了Rrs增加和Ers升高；肥胖哮喘模型組Crs低于陰性對照組，但無顯著性差異(P>0.05)，給與馥感啉治療后，Crs升高，以馥感啉 23.44 g·kg-1組升高差異具有顯著性(P<0.05)見Tab 2。

Tab 2 Effect of Fuganlin oral liquid tablets on breathing function of mice )

3.3 組織病理學檢查結果HE染色結果顯示，肥胖哮喘模型組小鼠肺臟出現不同程度細支氣管黏膜增高，主要表現為細支氣管管腔變小，黏膜擠壓增高。馥感啉治療后，細支氣管黏膜增高明顯緩解。MASSON 染色結果可見肥胖哮喘模型組膠原蛋白沉積面積較陰性對照組明顯增加，馥感啉對OVA誘導的膠原蛋白沉積有明顯的抑制作用。見Tab 3，Fig 2，3。

Fig 3 The pathological changes of lung tissues affected by Fuganlin oral liquid (MASSON×200)

Tab 3 Effect of Fuganlin oral liquid tablets on thickness of bronchial mucosa of lung tissues of mice )

3.4 馥感啉對肥胖哮喘模型炎癥的影響與陰性對照組比較，肥胖哮喘模型組白細胞總數升高，但差異無顯著性(P>0.05)，馥感啉治療后抑制了血液中白細胞總數增加；與陰性對照組比較，肥胖哮喘模型組血清中IgE含量、肺組織中SP含量明顯升高(P<0.05)，馥感啉治療后抑制了血清中IgE及肺組織中SP表達，提示馥感啉對肥胖哮喘模型具有抗炎效果。見Tab 4，5。

Tab 4 Effect of Fuganlin oral liquid on total white blood cells and IgE in mouse

3.5 馥感啉對肥胖哮喘小鼠肺組織中TGF-β1、Smad3及SARA的影響ELISA結果表明,肥胖哮喘模型組與陰性對照組比較TGF-β1水平明顯升高，在馥感啉干預治療后TGF-β1水平明顯降低(P<0.05)；同時,Smad3的磷酸化水平在肥胖哮喘模型組明顯升高(P<0.05)，而升高的磷酸化Smad3能夠被馥感啉抑制。IHC結果表明,Smad3及SARA蛋白水平在模型組表達較陰性對照組明顯升高(P<0.05)，經馥感啉治療后Smad3及SARA在肺組織表達水平下調，提示馥感啉參與調控TGF-β1/Smad3信號轉導。見Tab 6，Fig 4，5。

Tab 5 Effect of Fuganlin oral liquid on SP in lung tissues of mice

Tab 6 Effect of pediatric treatment of Fuganlin oral liquid tablets on TGF-β1 and Smad3 in mouse lung tissues

4 討論

有研究表明，強制振蕩技術(FOT)是評估成人和兒童支氣管高反應性的可靠方法[8]。FOT技術在正常潮氣呼吸期間，通過疊加振蕩壓力或流動波來測量呼吸系統阻抗[8- 9]。阻抗的實際部分為呼吸系統阻力(Rrs)，反應呼吸系統的總體阻力，包括氣道組織以及胸壁的影響，是呼吸系統的總體表征；阻抗的虛擬部分為呼吸系統抵抗，其反映呼吸系統彈性和順應性。在本研究中建立肥胖哮喘模型，馥感啉治療之后檢測小鼠呼吸功能，結果顯示，肥胖哮喘模型組Rrs顯著高于陰性對照組，經馥感啉治療后小鼠Rrs降低，Crs升高，有效改善呼吸功能。表明馥感啉可以通過調節呼吸系統功能改善哮喘癥狀。

Fig 4 Expression of Smad3in lung tissues affected by Fuganlin oral liquid (×200)

Fig 5 Expression of SARA in lung tissues affected by Fuganlin oral liquid (×200)

Fig 6 TGF-β1/SMAD3 signaling path way

肥胖型哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病[10]，在本研究中結果顯示，馥感啉能有效抑制小鼠血液中白細胞總數及血清中Ig E升高。SP廣泛存在于氣管及小支氣管的氣道平滑肌、氣道上皮、黏膜下層及血管周圍[11]，可促進淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核巨噬細胞等炎性細胞釋放炎性因子，造成炎癥反應。同時，SP高度釋放促進氣管黏液分泌，使氣道阻力增加，參與氣道高反應性的形成[12]。馥感啉能有效抑制肥胖哮喘小鼠肺組織SP含量增高，表明馥感啉對肥胖哮喘小鼠模型肺組織炎性及氣道高反應性有明顯的抑制作用。

哮喘的慢性氣道炎癥如果不能得到有效控制，在反復損傷和修復過程中，氣道平滑肌、上皮、血管和細胞外基質發生不可逆的改變從而導致肺功能降低，即發生氣道重塑[13]。TGF-β1與氣道重塑密切相關，分泌過高刺激肺組織支氣管上皮細胞結構改變，使Smad與β2微管蛋白分離，Smad2或Smad3與Smad錨激活受體SARA結合，被呈遞給TGF-β/activin受體復合物接受磷酸化后與Smad4形成復合體,從而激活轉錄反應，影響支氣管上皮細胞及氣道平滑肌增殖(Fig 6)[14]。在本研究中，ELISA結果顯示經馥感啉治療后肺組織中TGF-β1、Smad3含量明顯降低，IHC結果表明馥感啉可以有效抑制Smad3及SARA蛋白表達水平升高。HE染色觀察到肥胖哮喘模型組細支氣管管腔變小，黏膜擠壓增高，Masson染色結果可見肥胖哮喘模型組膠原蛋白沉積增加等氣道重塑的表現，經馥感啉治療后能夠緩解上述氣道重塑的病理變化。以上結果表明馥感啉可能通過TGF-β1/Smad3信號減少膠原沉積和抑制細支氣管基底膜增厚進而緩解氣道重塑。

綜上所述，馥感啉具有改善肥胖哮喘小鼠氣道炎癥，降低氣道高反應性，改善呼吸功能，拮抗氣道重塑的作用，其機制可能與TGF- β1/Smad3信號通路有關。