加味獨活寄生合劑緩解小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎過程中腸道菌群的參與機制

易南星，米倚林，許曉彤，李納平，嚴 可，鄺高艷，盧 敏

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅形成和滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的致殘性疾病，臨床表現(xiàn)主要為疼痛、功能障礙和關(guān)節(jié)畸形[1]。OA給患者及社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)，隨著全球人口老齡化和肥胖人數(shù)日益增加，OA正變得越來越普遍[2]。然而，OA的發(fā)病機制尚不十分清楚，也缺乏有效的治療藥物。

腸道菌群作為腸道微生態(tài)的重要組成部分，直接或間接地參與人體的免疫調(diào)節(jié)、能量供應(yīng)、消化吸收、脂肪代謝等多種生理病理過程[3]。生理情況下，腸道菌群與機體及外界環(huán)境間保持相對平衡的狀態(tài)，以維持機體穩(wěn)態(tài)，而這種平衡一旦被打破，便可能引起腸道菌群失調(diào)乃至疾病[4]。在OA研究中，基于“腸道-關(guān)節(jié)”軸理論，越來越多的研究探索腸道微生態(tài)在OA病程中的作用，研究表明，腸道菌群可能參與關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨關(guān)節(jié)炎引起的疼痛[5]。

加味獨活寄生合劑是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由多名老中醫(yī)經(jīng)驗方經(jīng)過嚴格的制備工藝制成，其臨床療效優(yōu)良，課題組前期采用超高效液質(zhì)聯(lián)用分析加味獨活寄生合劑及含藥血清中有效成分[6]，并從多方面證實其療效機制。中醫(yī)藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路的特點。已有報道加味獨活寄生合劑對于膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)有治療作用[7-8]，但此過程中是否有腸道菌群的參與還未見報道。故本研究擬采用16S rRNA測序技術(shù)研究加味獨活寄生合劑對KOA模型小鼠腸道菌群的影響，以期從“腸道-關(guān)節(jié)”軸角度闡釋加味獨活寄生合劑治療KOA的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物8周齡 ♂ C57BL/6小鼠18只，SPF級，飼養(yǎng)于溫度(20～26)℃、相對濕度40%～70%，每小時通風(fēng)換氣15次，光照12 h/12 h明暗交替環(huán)境。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心訂購，合格證號SCXK(湘)2019-0004，所有動物實驗均符合湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的規(guī)定。

1.2 藥物加味獨活寄生合劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，組成：獨活6 g，桑寄生18 g，杜仲12 g，牛膝6 g，細辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防風(fēng)6 g，川芎6 g，黨參12 g，甘草3 g，當(dāng)歸12 g，白芍10 g，熟地黃15 g，制天南星6 g，黃芩6 g，木瓜12 g，威靈仙12 g。制備流程：將以上19味藥加水浸泡0.5 h，煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，煎液濾過、合并，濃縮成250 mL后分裝備用。

1.3 試劑與儀器脫毛膏(利潔時)，異氟烷(瑞沃德)，多聚甲醛、乙二胺四乙酸、無水乙醇、氨水、二甲苯(國藥)，番紅O染液，固綠染液，石蠟，中性樹膠(Sigma)，蘇木精(Wellbio)，DAB試劑盒(中杉金橋)，Ⅱ型膠原抗體(Proteintech)。小動物麻醉機(Matrx VMR 美國)，組織脫水機(Leica，TP1020)，組織包埋機(Leica，EG1150C)，組織切片機(Leica，RM2235)，組織展片機(Leica，HI1210)，組織烤片機(Leica，HI1220)，全片掃描儀(Olympus)。

1.4 KOA模型制備、分組及給藥小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機數(shù)法將小鼠分為假手術(shù)組、KOA模型組、KOA模型+加味獨活寄生合劑組(簡稱給藥組，下同)，6只/組。按文獻方法采用內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)(destabilization of medial meniscus，DMM)手術(shù)誘導(dǎo)建立KOA模型[9]，簡述如下：右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶之間開0.5 cm切口，顯微鏡下暴露、剪斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶，縫合切口。假手術(shù)組：在相同部位開0.5 cm切口，縫合切口，碘伏消毒，放回籠內(nèi)，等待小鼠蘇醒。給藥組：加味獨活寄生合劑參考人體劑量(125 mL·d-1)，并按人(70 kg)和小鼠(20 g)體表面積折算等效劑量，小鼠劑量為16.25 mL·kg-1，于術(shù)后1周灌胃給藥。另外兩組灌予生理鹽水，每天1次，持續(xù)至第8周。

1.5 關(guān)節(jié)軟骨番紅O-固綠染色膝關(guān)節(jié)取材后，4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA脫鈣液脫鈣14 d，每3 d更換脫鈣液1次，脫鈣完成后流水沖洗標(biāo)本2 h，自動脫水機進行脫水透明處理，石蠟包埋，4 μm切片，烤片3 h后進行番紅O-固綠染色，中性樹膠封片后顯微鏡采集圖像，觀察關(guān)節(jié)軟骨變化情況。

1.6 關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原免疫組化染色60 ℃烤片3 h，二甲苯、梯度乙醇中脫蠟、脫水、透明，蒸餾水浸洗5 min；37 ℃恒溫箱中酶修復(fù)抗原30 min，PBS洗3次；Ⅱ型膠原抗體孵育(1:1 000)，4 ℃冰箱中過夜，復(fù)溫30 min，PBS浸洗3次；二抗常溫孵育30 min，PBS浸洗3次；DAB顯色，室溫孵育約3 min，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌；蘇木精復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、顯微鏡觀察攝片。

1.7 腸道內(nèi)容物高通量測序收集小鼠結(jié)腸樣本，-80 ℃保存。DNA提取試劑盒提取糞便樣本總DNA，dsDNA HS Assay Kit for Qubit試劑盒測定DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。采用引物341F和805R通過PCR擴增V3-V4區(qū)域，純化與定量后，構(gòu)建測序文庫。采用Qiime 2分析流程，調(diào)用DADA2對Raw Data進行去噪，以100%的相似度聚類，對低質(zhì)量序列進行去除和校正、算法識別去嵌合等，去噪序列直接去冗余，獲得擴增子序列變異(amplicon sequence variants，ASV)信息。將ASV的代表序列與 Silva-132-99數(shù)據(jù)庫中的模板序列進行比對，得到所有ASV在微生物門、綱、目、科、屬、種分類水平下的菌群信息。通過分類學(xué)組成分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、LefSe分析和MetaCyc代謝途徑預(yù)測等方法對腸道菌群進行分析。

2 結(jié)果

2.1 加味獨活寄生合劑對關(guān)節(jié)軟骨的影響番紅O-固綠染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠關(guān)節(jié)軟骨、半月板形態(tài)正常，軟骨面光滑完整，軟骨厚度正常，無明顯病理表現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，模型組均出現(xiàn)軟骨面不完整，軟骨厚度丟失，半月板缺損等明顯病理表現(xiàn)，脛骨側(cè)關(guān)節(jié)軟骨面積與國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)評分差異均有顯著性(P<0.01)，說明KOA模型成功建立。與模型組比較，給藥組軟骨面更加完整，軟骨厚度增加，細胞外基質(zhì)丟失減少，脛骨側(cè)軟骨面積統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，兩組間差異具有顯著性；OARSI評分發(fā)現(xiàn)，模型組評分比假手術(shù)組明顯升高，加味獨活寄生合劑治療后OARSI分值明顯降低，番紅O-固綠染色結(jié)果表明，加味獨活寄生合劑能夠減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷，延緩了KOA的進展(見Fig 1)。

Fig 1 Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on articular cartilage

2.2 加味獨活寄生合劑對關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的影響Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)中最主要的組成成分，能反映關(guān)節(jié)軟骨的退變程度。膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原陽性染色明顯，分布均勻，表明Ⅱ型膠原含量豐富，細胞外基質(zhì)無明顯降解。與假手術(shù)組比較，模型組關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原陽性染色明顯變淺，且分布不均勻。與模型組比較，加味獨活寄生合劑組關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原陽性染色增加，分布較均勻。實驗結(jié)果表明，加味獨活寄生合劑能夠增加關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原的含量，減輕細胞外基質(zhì)降解，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，見Fig 2。

Fig 2 Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on collagen Ⅱ

2.3 加味獨活寄生合劑對腸道菌群豐度的影響實驗結(jié)果顯示：各組之間腸道菌群在門、綱、目、科、屬、種水平上均體現(xiàn)出差異。在門水平上，厚壁菌門相對豐度在各組依次表現(xiàn)為，假手術(shù)組(72.7%)，模型組(30.1%)，給藥組(32.3%)；變形菌門相對豐度為假手術(shù)組(12.9%)，模型組(13.9%)，給藥組(38.3%)；擬桿菌門相對豐度為假手術(shù)組(9.0%)，模型組(38.4%)，給藥組(22.6%)。在目水平上，擬桿菌目相對豐度為假手術(shù)組(8.9%)，模型組(38.2%)，給藥組(22.2%)。在屬水平上，乳桿菌屬相對豐度在各組依次表現(xiàn)為，假手術(shù)組(64.1%)，模型組(16.3%)，給藥組(6.9%)；阿克曼菌屬表現(xiàn)為假手術(shù)組(3.1%)，模型組(9.9%)，給藥組(0.6%)，見Fig 3。

Fig 3 Effect of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on abundance of intestinal

2.4 加味獨活寄生合劑對腸道菌群Alpha多樣性的影響Alpha多樣性用于分析樣本內(nèi)的微生物群落多樣性，單樣本的多樣性分析可以反映微生物群落的豐富度和多樣性，Observed表示實際觀察到的ASV種類數(shù)；用Chao1和ACE指數(shù)反映樣本的豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)反映多樣性。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組與給藥組Chao1指數(shù)均具有明顯差異，表明KOA模型小鼠腸道菌群生物多樣性發(fā)生明顯變化。與模型組比較，給藥組Chao1、Observed、Simpson指數(shù)有差異趨勢，表明加味獨活寄生合劑能夠影響KOA模型小鼠腸道菌群豐富度和多樣性，見Fig 4。

Fig 4 Effects of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on alpha diversity of intestinal flora

2.5 加味獨活寄生合劑對腸道菌群Beta多樣性的影響B(tài)eta多樣性分析以樣品間距離反映物種差異程度，主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)和非度量多維尺度法(Non-metric multidimen-sional scaling，NMDS)是兩種研究數(shù)據(jù)Beta多樣性的可視化方法。本實驗結(jié)果表明，3組之間兩兩比較差異均大于組內(nèi)的差異(R=0.704)，3組之間腸道菌群結(jié)構(gòu)差異具有顯著性。PCoA分析顯示，組內(nèi)距離較近，表示差異性較小，組間距離遠，差異性大，PCoA1能夠反映出各組間64.8%的差異性，PCoA2為23.4%；NMDS分析體現(xiàn)出與PCoA一致的實驗結(jié)果，見Fig 5。

Fig 5 Effects of Jiawei Duhuo Jisheng Mixture on beta diversity of intestinal flora

2.6 標(biāo)志菌群LefSe分析采用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LefSe)在不同組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)志菌群(P<0.05)。LefSe分析結(jié)果顯示，3組均存在豐度差異明顯的物種。假手術(shù)組中，乳桿菌目(Lactobacillales)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、厚壁菌門(Firmicutes)、Anaerostipes等物種豐度差異明顯；模型組中，δ變形菌綱(Deltaproteobacteria)，脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、梭桿菌門(Fusobacteria)、羅伊乳桿菌(Lactobacillus-reuteri)、放線菌科(Actinomycetaceae)等物種豐度差異顯著；給藥組中，變形菌門(Proteobacteria)，韋榮球菌屬(Veillonella)，奈瑟菌科(Neisseriaceae)，假單胞菌目(Pseudomonadales)等物種豐度差異顯著。從Fig 6中可以看出，模型組和給藥組差異菌群數(shù)量均增加，給藥組增加更明顯，而這些差異菌是否在KOA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，或是加味獨活寄生合劑發(fā)揮療效的潛在菌群，還有待深入研究。

Fig 6 LefSe analysis of marker flora

2.7 腸道菌群MetaCyc分析為了確定腸道微生物區(qū)系的分類變化是否影響其功能，本研究通過Picrust2對代表性序列進行功能預(yù)測，MetaCyc(https://metacyc.org/)是通過實驗手段闡釋代謝通路的數(shù)據(jù)庫。本實驗MetaCyc結(jié)果顯示，與模型組比較，給藥組在脂肪酸β-氧化I(fatty acid β-oxidation I)、己糖醇發(fā)酵乳酸、甲酸、乙醇(hexitol fermentation to lactate，formate，ethanol and acetate)、L-色氨酸生物合成超通路(superpathway of L-tryptophan biosynthesis)、乙醛酸循環(huán)(glyoxylate cycle)、醇代謝和降解超通路(superpathway of glycol metabolism and degradation)等代謝通路增強，而paromamine生物合成Ⅱ(paromamine biosynthesis Ⅱ)和核糖霉素生物合成(ribostamycin biosynthesis)代謝通路減弱見Fig 7。

Fig 7 MetaCyc analysis of intestinal flora

3 討論

加味獨活寄生合劑，以治療痹證經(jīng)典方獨活寄生湯為基礎(chǔ)，加制天南星、黃芩、木瓜、威靈仙制備而成，臨床廣泛應(yīng)用于KOA的治療。課題組前期研究表明，加味獨活寄生合劑可以抑制Wnt信號通路、調(diào)節(jié)Sox9、Ⅱ型膠原蛋白表達，促進軟骨細胞增殖和分化[7]；此外，加味獨活寄生合劑可以減少關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6和TNF-α含量，抑制炎癥反應(yīng)，減輕疼痛，改善患者關(guān)節(jié)功能和臨床癥狀[8]。本實驗表明，加味獨活寄生合劑能夠減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷，延緩KOA疾病進程。研究表明，腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)及其代謝物與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腸道菌群通過調(diào)節(jié)遠端器官的免疫功能或代謝物通過受損的腸上皮細胞直接進入血液循環(huán)系統(tǒng)，合成并釋放炎癥相關(guān)因子誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進OA關(guān)節(jié)繼發(fā)性炎癥的發(fā)展[10]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，加味獨活寄生合劑能夠調(diào)控KOA模型小鼠腸道菌群微生態(tài)、增加菌群豐度、改善菌群多樣性、影響菌群代謝。因此，調(diào)控腸道菌群微環(huán)境可能是加味獨活寄生合劑延緩KOA進程的潛在機制。

基于16S rRNA技術(shù)研究腸道菌群，多采用ASVs、Alpha與Beta多樣性等指標(biāo)進行分析與評價。ASVs劃分以99%的序列相似度作為OTU劃分閾值，在某一確定的分類水平進行序列雙端合并，對不同來源的微生物群落樣本進行互相比較[11]。Alpha多樣性主要反映組內(nèi)樣本的測序深度，以此判斷微生物多樣性是否具有分類學(xué)意義。本文研究發(fā)現(xiàn)加味獨活寄生合劑組能夠增加KOA小鼠腸道菌群Alpha多樣性的豐富度指數(shù)(Chao 1)和多樣性指數(shù)(Simpson)，表明加味獨活寄生合劑具有多成分、多靶點進行干預(yù)的特性，但具體是調(diào)節(jié)腸道中何種菌群的豐度和多樣性從而起到治療作用尚不清楚，有待下一步深入研究。Beta多樣性分析考察不同組別之間群落結(jié)構(gòu)的差異性為主，通過PCoA分析和NMDS分析對菌群結(jié)構(gòu)進行自然分解，并通過對樣本定位、分析、歸類等方法觀測樣本之間的差異性。本實驗發(fā)現(xiàn)，Beta多樣性指數(shù)顯示組內(nèi)各樣本間群落差異性良好(R=0.704)，表示實驗重復(fù)性較好，具有可比性；組間差異有顯著性且PCoA分析與NMDS分析一致。證明加味獨活寄生合劑能夠調(diào)控腸道菌群豐富度和多樣性發(fā)揮干預(yù)KOA的作用。

運用分類學(xué)組成和聚類學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，加味獨活寄生合劑主要影響厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門，其所占比重之和超過總體菌群數(shù)量的95%。厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖發(fā)酵，其芽孢桿菌屬的主要作用是維持腸道微生態(tài)平衡[12]。研究表明，脆弱擬桿菌可降解腸黏膜屏障的重要組成成分-粘蛋白，粘蛋白降解可破壞腸黏膜屏障的完整性，另外，擬桿菌屬升高往往和腸道菌群紊亂有關(guān)，當(dāng)乳酸桿菌等有益菌減少時，腸道內(nèi)競爭抑制作用削弱，條件致病菌生長占優(yōu)勢，擬桿菌屬比例的增加，可上調(diào)細菌毒素，加重炎癥因子釋放[13]。本實驗結(jié)果表明，加味獨活寄生合劑能夠增加KOA模型小鼠腸道中厚壁菌門的豐度，且明顯降低擬桿菌門的豐度，改善厚壁菌門/擬桿菌門的比值，提示其治療作用可能與增加腸屏障保護功能菌，降低腸源性內(nèi)毒素釋放，減輕炎癥有關(guān)。阿克曼菌屬是近年來熱門研究菌屬，約占疣微菌門的83%，占總腸道微生物的1%～4%，具有轉(zhuǎn)化腸道上皮黏蛋白為碳源、氮源的生理功能，可減弱腸道黏液屏障厚度，阿克曼菌屬能加劇鼠傷寒沙門菌誘發(fā)的腸道炎癥，破壞宿主腸道黏膜的微生物平衡[14]。本實驗中，模型組阿克曼菌屬的豐度明顯增加，而加味獨活寄生合劑明顯降低了腸道中阿克曼菌屬的豐度，推測其通過調(diào)控腸道菌群抑制炎癥反應(yīng)，保護腸道粘膜發(fā)揮治療作用。本研究還發(fā)現(xiàn)加味獨活寄生合劑對腸道菌群脂肪酸、糖和氨基酸等代謝途徑均有影響(P<0.05)。脂肪酸是腸道菌群及其宿主腸上皮細胞的重要能量來源，能夠維持腸道酸堿平衡、修復(fù)腸黏膜損傷、緩解腸道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主腸道免疫并抑制有害病原菌生長[15]。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示通過調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)并改善其代謝途徑可能是加味獨活寄生合劑治療KOA的潛在機制之一。目前，基于16S rRNA 測序技術(shù)用于藥物療效評價，尤其對探討中藥復(fù)方在臨床治療疾病及其機制方面具有重要意義。但機體腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成復(fù)雜，部分菌群及其生物學(xué)意義尚無法完全檢測與詮釋，腸道菌群與藥物及藥物代謝物之間相互作用關(guān)系等未知領(lǐng)域還有待進一步深入研究。